T-Zell-Aktivierung mit nano-funktionalisierten Oberflächen

Die Aktivierung von T Lymphozyten, welche letztendlich in Wirbeltieren zur erworbenen Immunität führt, ist das vorherrschende Element in der Erkennung von antigenen (d.h.: fremden) Substanzen, die wiederum von viralen, bakteriellen, pilzlichen oder mutierten endogenen Proteinen abstammen. Vor deren Erkennung werden diese während der sogenannten Antigen-Prozessierung in kurze Peptidfragmente p (10-15 Aminosäuren) von Antigen- präsentierenden Zellen (APC) wie B Zellen und dentritischen Zellen abgebaut. Diese Fragmente werden anschließend auf der APC-Membran vom Haupthistokombatibilitätskomplex (MHC) präsentiert. Die produktive Bindung eines spezifischen T Zell Rezeptors (TCR) zu einem MHC, welches mit einem Peptid beladenen wurde, daß von einem Antigen abstammt, führt zuerst zu einer TCR Aggregation. Der Erkennungsprozeß selbst ist höchst sensitiv und spezifisch. T Lymphozyten erkennen sogar die Anwesenheit eines einzigen antigenischen pMHCs auf der Oberfläche einer APC unter Zehntausenden endogenen, die sich in ihrer Struktur auch noch sehr ähnlich sind. Immer noch wird kontroversiell diskutiert wie die zwischenzelluläre Bindung weniger TCRs zu deren Liganden in Beziehung mit der innerzellulären Signalkaskade steht, welche schließlich zur T Lymphozyten Aktivierung führt. Ist die vom Lymphozyten ausgelöste Aggregation der TCRs ein Mechanismus um die Rezeptorsignalisierung zu verbessern oder einfach nur eine Möglichkeit diese für den innerzellulären Abbau zu markieren? Als Doktorand habe ich verschiedene Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopietechniken eingesetzt, um die Interaktion Zell-gebundener TCRs und dessen Liganden pMHC in situ zu bestimmen. Als künstliche APC Membran verwendete ich eine unterstütze Lipid-Doppelschicht, welche aus den beiden Lipiden POPC und DOGS- Ni-NTA besteht. Letzteres bindet Histidine-markierte Proteine; im konkreten Fall hier fluoreszenz-markiertes pMHC, das kostimulierende Protein B7-1 und ein Integrin namens Interzelluläres Adhäsionsmolekül 1. Diese Proteinmischung stellt die Minimalanforderung für Peptid-spezifische T Lymphozyten Aktivierung dar. Im vorgeschlagenen Projekt werde ich verschiedene mustererzeugende Techniken zur Erzeugung nano- funktionalisierter Oberflächen verwenden, um mit deren Hilfe die räumlich-molekularen Bedingungen für Peptid- spezifische T Zell Aktivierung zu analysieren. Eine von Prof. Dr. J. P. Spatz entwickelte Methode ermöglicht mittels Nanolithographie von sich selbst-organisierenden und HAuCl4 enthaltenden Diblock-Kopolymer-Mizellen Oberflächenmuster von Goldpartikel (1-15 nm Durchmesser) mit variierenden Partikeldistanzen zu erzeugen. Anschließende Funktionalisierung der Goldnanopartikel mit spezifischen Proteinen in einer 1:1 Stöchiometrie erlaubt die Untersuchung der Interaktion zwischen einzelnen Proteinen und deren Gegenstück auf lebenden Zellen in Abhängigkeit von deren Dichte und räumlichen Anordnung. Im vorgeschlagenen Projekt werden diese Oberflächen mit einer Super-Auflösung-Mikroskopietechnik kombiniert um den Effekt verschiedener räumlicher Anordnungen (aggregiert, peripher oder zentral, zufällig verteilt) von an die Goldpartikel gebundenen pMHCs auf die T Lymphozyten Aktivierung mittels quantitativer Ca2+-Messung zu untersuchen. Zusätzlich werden diese nano-bemusterten Oberflächen mit dem während meiner Dissertation (Huppa et al., Nature 2010 (463) 963) studierten Lipid-Doppelschicht-System kombiniert und auf ihre Fähigkeit getestet die Zellmembran einer APC noch genauer widerzuspiegeln. In Vorversuchen habe ich bereits gezeigt, daß sich eine Lipid-Doppelschicht auf diesen nano-bemusterten Oberflächen ausbildet und funktionalisierte Proteine in der Lipid-Doppelschicht immer noch mobil sind.