NMR Charakterisierung des spannungsgesteuerten H+ Kanal Hv1

Der Transport von Ionen durch die Membranbarriere ist einer der fundamentalsten Prozesse des Lebens. Ionen permeation durch die Zellmembran wird durch transmembrane Ionenkanäle und Transportproteine katalysiert. Spannungsgesteuerte Ionenkanäle werden durch Spannungsänderungen innerhalb der Lipid-Doppelschicht aktiviert. Spannungsänderung werden mit Hilfe der Spannungssensordomäne detektiert. Diese Änderungen führen dazu, dass sich die Helices der Spannungssensordomäne relativ zu der Membrane bewegen, die Konformationsänderung ermöglicht das Öffnen eines selektiven Ionenkanals welcher sich über die Zellmembran erstreckt. Das erlaubt der Zelle, Ionen durch die Zellmembran zu transportieren. Diese Proteine sind unter anderem für die Erzeugung und Weiterleitung von Nervenimpulsen, dem Protonentransport aus der Zelle und für die Muskelkontraktion notwendig. Das erste Gen eines spannungsgesteuerten Protonenkanals wurde erst im Jahr 2006 entdeckt. Dieser besteht nur aus einer Spannungssensordomäne und einer C-terminalen Dimerisierungsdomäne, allerdings besitzt er keinen zusätzlichen Ionenkanal. Dies unterscheidet ihn von spannungsgesteuerten Na+ , Ca2+ und K+ Ionenkanälen. Der spannungsgesteuerte Protonenkanal bildet ein Dimer, wobei durch das Entfernen des cytoplasmatischen C-terminus das Protein als funktionales Monomer vorliegt, Hv1M. Protonentransfer durch den Protonenkanal ist nicht nur spannungsabhängig, sondern wird auch durch den pH- Gradienten innerhalb der Membran beeinflusst. Konformelle Änderungen sind essentiell für den Spannungsaktivierungs und pH- Detektions-mechanismus von Hv1. NMR ist eine der wenigen experimentellen Methoden die es erlauben dynamische Prozesse in atomarer Auflösung und auf einer breiten Zeitskala zu untersuchen. Im Rahmen dieses Projekts werden wir die NMR- Strukturen des offenen und des geschlossenen Zustandes des Ionenkanals Hv1M bestimmen. Zusätzlich zu den atomaren Koordinaten dieser Domäne, werden wir die dynamischen Zustände dieses Moleküls über ein breites Spektrum an Zeitskalen mit NMR Relaxationsexperimenten charakterisieren, um die intrinsische Dynamik zu verstehen, welche mit der Spannungsdetektion und dem Protonen Transfer von Hv1M gekoppelt ist. Wir erwarten dass unser Projekt eine umfassende atomistische Beschreibung des pH-abhängigen, spannungsgesteuerten Protonentransfermechanismus ergeben wird und dadurch zu einem besseren Verständnis von spannungsgesteuerten Protonenkanälen führen wird.

Im vorliegenden Projekt des Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung FWF wurde die Substraterkennung und der Substrattransport der mitochondrialen ADP/ATP Translokase (AAC) charakterisiert. AAC gehört zur Familie der mitochondrialen Carrier. Diese Familie an Transportern katalysiert den Transport von Metaboliten, Nucleotiden, Ionen und Vitaminen durch die innere mitochondriale Membran. Mehr als 40 unterschiedliche Carrier wurden im Menschen identifiziert, viele dieser Membranproteine sind in Stoffwechselerkrankungen involviert. Darüber hinaus sind mitochondriale Carrier auch von akademischem Interesse, da sie im Gegensatz zu vielen Transportern, mit üblicherweise einer Pseudo 2-fach Symmetrie eine Pseudo 3- fach Symmetrie aufweisen. Mittels Kernspinresonanzspektroskopie konnten wir zeigen dass AAC in zwei Konformationen vorliegt, die sich im chemischen Gleichgewicht befinden. Diese beiden Konformationen sind kritisch für den Substrattransport. Befindet sich das Substrat zusätzlich in Lösung, wird die Geschwindigkeitskonstante, mit der sich die beiden Konformationen in einander umlagern, erhöht. Das Binden des Transportinhibitors CATR hat hingegen den entgegengesetzten Effekt. Für einen weiteren Carrier, SCaMC, dessen Fähigkeit ATP zu transportieren durch Ca2+ reguliert wird, konnten wir zeigen, dass seine N- terminale Domäne (NTD) durch das Binden von Ca2+ eine ausgeprägte konformationelle Änderung erfährt. Diese Strukturänderung führt dazu, dass die NTD nicht mehr mit der Transmembranregion interagieren kann. Im Ca2+ ungebundenen Zustand ist die NTD partiell ungefaltet und interagiert spezifisch mit der Transmembrandomäne (TMD), wobei im Ca2+ gebundenen Zustand die NTD kompakt gefaltet ist, und dadurch nicht an die TMD binden kann. Unsere Daten deuten auf einen Deckelungsmechanismus für die Ca2+ abhängige Regulierung hin, in dem apo NTD einen Deckel für die TMD bildet. Das Binden von Ca2+ führt zur Öffnung des Deckels und ATP kann durch die TMD transportiert werden. Für den spannungsgesteuerten Protonenkanal, Hv1, wollten wir die Konformations und Dynamikänderungen während des Protontransports charakterisieren. Hv1 wird für die Herstellung von hohen Superoxidkonzentrationen in Phagozyten zum Eliminieren von Pathogenen benötigt. Weiters wird Hv1 in humanem Sperma exprimiert, wo es vermutlich an der Regulation der Beweglichkeit beteiligt ist. Wir waren in der Lage ein NMR- System für Hv1 zu etablieren, welches dazu verwendet wurde um strukturelle Informationen und Dynamikparameter zu messen. Diese experimentellen Daten werden zur Charakterisierung der intrinsischen Dynamik verwendet welche mit der Spannungsteuerung und dem Protonentransport gekoppelt ist. Die experimentell bestimmten strukturellen Informationen werden für eine ab initio Strukturrechnung herangezogen.