Fluoreszierende Sonden zur Detektion enzymatischer Aktivität

Im letzten Jahrzehnt etablierten sich molekulare fluorophore Sonden zu einem unverzichtbaren Instrument zur Erforschung der vielfältigen Funktionen von Enzymen in lebenden Organismen. Zelluläre Enzyme nehmen Schlüsselpositionen in zahlreichen biologischen und physiologischen Prozessen ein. Sie gewährleisten zelluläre Viabilität durch elektrische und ionische Gradienten, durch Weitergabe von chemischen und elektrischen Signalen, durch Zell-Entgiftung und steuern viele andere lebenswichtige Vorgänge. Besonders hervorzuheben ist die große und weitverbreite Enzymklasse der Glykosidasen, die für Abbau und Regulation der Kohlenhydrate verantwortlich ist. Das primäre Ziel dieses Projekts ist die Entwicklung latent-fluorophorer Moleküle, deren enzymatische Spaltung nach Transport in der Zelle einen geladenen und dadurch zellundurchlässigen fluorophoren Farbstoff freisetzt. Dieses ambitionierte Vorhaben kann durch Verknüpfung des enzymatischen Substrates mit dem Fluorophor über einen sich selbst-spaltenden Linker erreicht werden. Das vorgeschlagene strukturelle Design erlaubt den Gebrauch unterschiedlich geladener Abgangsgruppen, wodurch eine Feinabstimmung der pKa-Werte und somit der Einschluss der abgespaltenen Fluorophore in der Zelle erreicht werden kann. Die Zellverträglichkeit der abgespaltenen reaktiven Quinon-Methid- ähnlichen Strukturen wird durch intramolekulare Deaktivierungsreaktionen (6-endo-trig Zyklisierungen) bewerkstelligt. Die Voraussetzung zur funktionalen Optimierung von Enzymen durch gerichtete Evolution ist die nicht Toxizität der eingesetzten Linker. Anfänglich wird diese Strategie zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung von beta-Galaktosidase und beta-Glukosidase in E. Coli und Hefe Zellen getestet. Das beta-Galaktosidase Gen ist das am häufigsten eingesetzte Reporter Gen in der Molekularbiologie und wird zur Detektion von Krebszellen in Mäusen verwendet. Die Bestimmung der beta- Glukuronidase Aktivität in pflanzlichen Zellen mit Hilfe dieser fluorophorer Sonden andererseits soll eine Lokalisation des endoplasmatischen Retikulums erlauben. Aufbauend auf diesem Anwendungsspektrum könnte diese Strategie die Entdeckung neuartiger Biokatalysatoren und katabolischer Enzyme eröffnen. Des Weiteren soll die Synthese fluorophorer Proben für komplexere Kohlenhydrate eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung von verschieden Glykosidasen ermöglichen, die für den Biomasseabbau verantwortlich zeichnen (wie Zellulasen, Xylanasen, Hemizellulasen, Ligninasen, ...). Diese Enzyme besitzen großes Potential sowohl für die Herstellung von Biotreibstoffen aus Biomasse, als auch für die Synthese von biologisch relevanten, komplexeren Kohlenhydratstrukturen.

Im letzten Jahrzehnt haben sich fluorophore Sonden zu einem unverzichtbaren Instrument in der Erforschung der Funktion und Regulation von Enzymen in lebenden Organismen etabliert. Zelluläre Enzyme nehmen Schlüsselpositionen in zahlreichen biologischen und physiologischen Prozessen ein, gewährleisten zelluläre Viabilität durch elektrische und ionische Gradienten, durch Weitergabe von chemischen und elektrischen Signalen, durch Zell-Entgiftung und durch viele andere lebenswichtige Vorgänge. In diesem Erwin-Schrödinger Projekt wurden neuartige fluorophore Sonden für Ultra-HochdurchsatzScreening von enzymatischer Aktivität in Zellen entwickelt. Mittels Durchflusszytometrie (FACS) zeigte sich, dass diese molekularen Sonden für Hydrolasen verbesserte Fluoreszenzeigenschaften in Wasser-inÖl-in-Wasser (w/o/w) Emulsionen aufweisen. Im Verleich zu den traditionell verwendeten Fluorophoren, die sich von Coumarin und Fluorescein ableiten, werden sie länger in w/o/w Emulsionen retendiert. Diese Eigenschaft führt zu einer verbesserten Signalstabilität und zu einem verminderten Hintergrundrauschen. Momentan werden diese fluorophoren Sonden zur gerichteten Evolution von Glykosidasen und Glykosynthasen verwendet. Die entwickelten Glykosynthasen erlauben den Transfer von artifiziellen Kohlenhydraten mit bioorthogonalen funktionellen Gruppen auf komplexe Biomoleküle. Durch die bioorthogonalen funktionellen Gruppen wird gewährleistet, dass in weiterer Folge die biologische Funktion dieser Biomoleküle erforscht werden kann. Ein gegenwärtig weiteres Einsatzgebiet dieser Sonden liegt im Ultra Hochdurchsatz-Screening von Biomasse abbauenden Enzymen wie Glukosidasen, Zellobiohydrolasen und Zellulasen, die in der Herstellung von Biotreibstoffen verwendet werden.