Entwicklung einer neuen Rekombinationstechnik für Cellulasen

Cellulose als Hauptbestandteil pflanzlicher Zellwände stellt das am weitverbreitetsten Biopolymer auf der Welt dar. Der Abbau dieses Polysaccharides zu Glucose ist eine vielversprechende Alternative zur Herstellung von biologischen Treibstoffen wie etwa Ethanol und diverser Chemikalien. Unter dem Gesichtspunkt der Treibhausgasreduzierung und zur Bereitstellung alternativer Energiequellen nimmt der effektive Abbau von Cellulose eine immer wichtigere Rolle ein. Aus biotechnologischer Sicht sind dafuer jedoch effektivere und thermostabilere Enzyme zum Abbau notwendig. Thermostabile Enzyme weisen diverse Vorteile auf: zum einen sind thermostable Enzyme während der Produktionsprozesse länger stabil und fuehren so zu einer höheren Produktausbeute und zum anderen erhoeht sich aufgrund des Arrhenius Effektes die spezifische Aktivitaet der Enzyme bei höheren Inkubationstemperaturen. In den letzten Jahrzehnten haben sich immer fortschrittlichere biochemische und molekularbiologische Methoden zur Proteinrekombination entwickelt. Parallel wurden sukzessiv verbesserte Computermodelle entwickelt, die Voraussagen über die Konsequenzen von Mutationen und über die Funktionalität neu generierter Enzyme ermöglichen. Ein Modell bekannt als SCHEMA vereint diese verschiedenen Ansätze miteinander um verwandte Proteine miteinander zu kombinieren. Dies führt zur Generierung von sogenannten chimären Proteinen die veränderte Eigenschaften aufweisen. Basierend auf die vorhandene Expertise wird eine neue Methode entwickelt, die es ermöglicht entfernt verwandte Enzyme miteinander zu rekombinieren um chimäre Proteine mit verbesserten Eigenschaften zu erhalten. Der Fokus richtet sich hierbei auf die Generierung thermostabilerer Enzyme. Die Etablierung dieser neuen Rekombinationmethode soll dazu beitragen die Konsequenzen von Aminosäureaustauschen auf Funktion und Struktur besser zu verstehen, sowie die bestehenden Computermodelle zu verfeinern.

In den letzten Jahrzehnten hat sich ein zunehmendes Interesse an der Entwicklung von nachhaltigeren Alternativen chemischer Herstellungsprozesse unter Verwendung von biologischen Katalysatoren (Enzymen) gebildet. In diesem Zusammenhang ist es in vielen Fällen notwendig spezielle Eigenschaften wie etwa Stabilität, Reaktionsgeschwindigkeit oder Spezifität dieser biologischen Katalysatoren zu optimieren. Je nach Fragestellung, Anwendung und dem jeweiligen Enzym stehen verschiedene Strategien zur Verfügung. Um spezifische Prozesse wie etwa die thermale Inaktivierung von Cellulasen oder die katalytische Aktivität von P450 Enzymen besser zu verstehen und gezielt zu steuern haben wir basierend auf Aminosäuresequenzen und dreidimensionalen Proteinstrukturen spezifische Mutationen eingefügt. Um Terpen-Synthasen mit optimierten Eigenschaften zu generieren wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. Zum einen wurde ein im Arnold Labor entwickeltes computergestütztes Modell verwendet um Terpene Synthasen miteinander zu rekombinieren. Die so entstandenen chimaeren Enzyme wurden auf die gewünschten Eigenschaften hin untersucht. Alternativ zu diesem Ansatz wurde parallel dazu ein neuer High-throughput Screen entwickelt, der zum ersten Mal einen Directed Evolution Ansatz für Terpen Synthasen ermöglichte. Mit Hilfe dieser Strategie wurden Terpen-Synthasen mit verbesserten Eigenschaften wie etwa höherer Thermostabilität isoliert.