Funktionelle Annotation von `orphan´-CpG-Insel-Transkripten

CpG Inseln (CGI) im Genom von Vertebraten sind etwa 1kb lange CpG-reiche und GC-reiche Regionen und sind im Gegensatz zum Großteil des Genoms meist unmethyliert. In Maus und Mensch colokalisieren CGI mit der Mehrheit der Transkriptionsstarts annotierter Gene. Ein signifikanter Anteil von CGI liegt jedoch in intergenischen oder intragenischen Regionen. Aufgrund einer fehlenden Assoziation mit annotierten Transkripten werden diese als "Orphan-CGI" (Waisen-CGI) bezeichnet. Deren häufige Konservierung deutet auf eine wichtige Rolle in der Genomregulation hin und "Orphan-CGI" wurden als Promotoren für nicht-Protein-codierende RNS (ncRNS) postuliert. Durch die Entwicklung von Methoden wie "Whole Transcriptome Shotgun Sequencing" (RNS-Seq), welche eine neutrale Analyse des Transkriptoms ermöglichen, wurde erkannt, dass der Großteil des nicht- ribosomalen Transkriptoms aus ncRNS besteht. In den letzten Jahren wurden tausende ncRNS beschrieben, jedoch fehlt für die meisten eine weitere experimentelle Charakterisierung und funktionelle Analyse. Die wenigen bisher als funktionell beschriebenen ncRNS fungieren auf diverse Arten im zellulären System, wobei die meisten eine kritische Rolle in der Regulation der Genexpression spielen. In der ersten Phase des vorgeschlagenen Forschungsprojektes werde ich eine umfassende Übersicht des "Orphan- CGI" Transkriptoms erstellen. Ein murines neuronales embryonales Zelldifferenzierungssystem, das mehrere Entwicklungsstadien repräsentiert, wird verwendet werden um Transkriptomsets mittels Strang-spezifischer RNS- Seq zu erstellen. Die Transkriptionsstarts neuentdeckter Transkripte werden mit "Orphan-CGI" verglichen um jene Transkripte zu identifizieren, die von einer "Orphan-CGI" entstehen. Diese Transkripte werden mittels bioinformatischer, biochemischer und molekularbiologischer Methoden weiter charakterisiert. Funktionelle Analyse eines Kandidatensets wird durch genetische Knockouts der "Orphan-CGI"-Promotoren und Knockdowns der neuen Transkripte erfolgen. Die Effekte dieser genetischen Manipulationen werden zunächst im neuronalen embryonalen Zelldifferenzierungssystem und anschließend in vivo in Knockout- und Knockdown-Mäusen analysiert werden. Phänotypische Analyse wird mittels genomweiter Expressionsanalyse und Charakterisierung assoziierter epigenetischer Modifikationen wie DNS-Methylierung und Chromatinmodifikationen erfolgen um die funktionellen Rollen von "Orphan-CGI"-Transkripten aufzudecken.