Konformationsaenderungen bei RF1

Das Ribosom ist eine der größten zellulären Strukturen die man bis heute kennt und seine Aufgabe ist es die genetische Information von Boten-RNA (mRNA) in Proteine zu übersetzen, mit Hilfe von Transfer-RNA (tRNA). Dieser Prozess wird in vier Schritte unterteilt: Initialphase, Elongationsphase, TerminationundRegenerierung. Das katalytische Zentrum des Ribosoms ist das Peptidyl-Transferase Zentrum und es befindet sich in der großen ribosomalen Untereinheit (50S Untereinheit) und besteht nur aus RNA. Die kleine ribosomale Untereinheit (30S Untereinheit) beinhaltet das Dekodierungszentrum, weiters besitzt das Ribosom drei tRNA Bindungsstellen: die A-, P- und E-Stelle. Wenn ein Stop-Codon sich in der A-Stelle befindet, beginnt die Proteinsynthese-Phase der Termination. Das Stop-Codon wird von Klasse I Release Faktoren erkannt (RF1 oder RF2 in E.coli), die ans Ribosom binden und in weiterer Folge wird das neu-synthetisierte Peptid freigesetzt. Weil Fehler in diesem Schritt der Translation kostspielig für die Zelle sind, arbeitet der Release-Faktor mit hoher Genauigkeit. Die Termination ist ein dynamischer Prozess und kann nicht ausschließlich mit Kristallstrukturen erklärt werden. Das Ziel dieses Antrags ist, die Beleuchten des Prinzips das diesem genauen Erkennungsprozess des Release-Faktors unterliegt. Eine bestehende Hypothese besagt, dass eine Konformationsänderung bei RF1 bzw RF2 eine entscheidende Rolle dabei spielt und neueste Erkenntnisse unterstützen diese Theorie. Es ist demzufolge möglich dass die hohe Genauigkeit mit welcher der Release-Faktor ein Stop-Codon erkennt an eine Konformationsänderung gekoppelt ist, die in weiterer Folge zu einer stabileren Bindung des Faktors an das Ribosom führt. Mit Hilfe von neuen Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) Experimenten wollen wir Änderungen in der RF1/RF2 Struktur nach dem Binden ans Ribosom sichtbar machen. Nach dem Erkennen des Stop-Codons und dem Freisetzen des Peptids, bindet der Release-Faktor 3 an das Ribosom und bewirkt die Freisetzung von RF1 beziehungsweise RF2. Durch die hier präsentierte neue Fluoreszenz-Methode werden wir in der Lage sein Strukturänderungen von RF1/RF2 auch in diesem Schritt festzustellen. Diese Studien haben medizinische Relevanz, da das Ribosom ein Angriffspunkt viele gebräuchlicher Antibiotika ist. Außerdem bieten diese Experimente die Möglichkeit neue Erkenntnisse im Bereich der Terminationsphase der Proteinsynthese zu gewinnen, die auf Grund der flexiblen Natur dieses Prozesses nicht allein durch Kristallstruktur-Studien möglich sind.

Das Ziel meines Projektes war es, die Bedingungen, Eigenschaften und die Chronologie eines Konformationsänderung in RF1 zu identifizieren. Hochauflösende Kristallstrukturen zeigten, dass RF1 in einer offenen Konformation vorliegt, wenn es an das Ribosom gebunden ist, aber eine geschlossene Konformation einnehmen könnte, wenn es nicht an das Ribosom gebunden ist. Es ist nicht klar, ob nur die offene Form von RF1 an das Ribosom bindet oder die geschlossene Form von RF1 an das Ribosom bindet und dann eine Konformationsänderung in den offenen Zustand stattfindet. Ich verwendete transition metal ion -FRET-Experimente (tmFRET), um die Konformation von RF1 in Abwesenheit und in Gegenwart des Ribosoms festzustellen. Diese innovative Technologie, die noch nie für eine solche Fragestellung eingesetzt worden. Die Ergebnisse zeigen, dass RF1 eine große Konformationsänderung von einer geschlossenen zu einer offenen Form bei der Bindung an das Ribosom erfährt. Dieses Ergebnis lässt den Schluss zu, dass eine hohe Genauigkeit während der Terminations bei der Peptidproduktion durch eine Verknüpfen der Stopp-Codon-Erkennung durch RF1 mit einer Änderung der Konformation vom geschlossenen in den offenen Zustand erreicht wird. Dieser Vorgang erhöht die Bindungsaffinität von RF1 zum Ribosom und induziert die Freisetzung des neu gebildeten Peptids. Die Ergebnisse dieses Projekts tragen nicht nur zum Wissen dieses Forschungsfeldes bei, sondern haben auch das Potential, die zukünftige Entwicklung von Antibiotika zu lenken.