Engineering multivalenter Proteinglykosilierung in E. coli

Im Projekt Engineering multivalenter Proteinglykosylierung in Escherichia coli: Verbesserte Glykanwechselwirkungen und Therapeutika der nächsten Generation, wird ein künstliches Proteinglykosylierungssystem weiterentwickelt, das im Zytoplasma von E. coli abläuft. Ziel des Projektes ist die Entwicklung neuartiger multivalenter Glykokonjugate, die als antipathogene Wirkstoffe zur Anwendung kommen sollen. Multivalenz ist generell ein wesentliches Merkmal von Glykanwechselwirkungen und demnach für die Wirksamkeit neuartiger Therapeutika entscheidend. Das verwendete Glykosylierungssystems basiert auf einer kürzlich entdeckten bakteriellen Asparagin-Glykosyltransferase (NGT), die einen einzelnen Glukoserest auf die Aminosäure Asparagin überträgt. Im Rahmen dieses Projektes sollen mehrere Glykosylierungsstellen in diverse Carrier eingeführt werden, um eine kontrollierte multivalente Präsentation der Glykane zu erreichen. Im Labor von Prof. Markus Aebi werde ich Proteine auf ihr Potenzial zur multivalenten Präsentation von Glykanen untersuchen. Die Anforderungen für eine zuverlässige und effiziente NGT-vermittelte Glukosylierung sollen definiert und anschließend an therapeutisch relevanten Proteinen sowie neuartigen Carriern und virusähnlichen Partikeln angewendet werden. Die korrekte Proteinfaltung der generierten Glykokonjugate wird mittels Standardanalysen ermittelt, deren Glukosylierungsgrad mittels Massenspektrometrie. Ein Hauptziel dieses Projektes ist die Entwicklung neuer, maßgeschneiderter Glykanbiosynthesewege. Dazu werden die entsprechenden Gene in E. coli eingeführt, um entweder GM1-Oligosaccharide (GM1os) oder Globopentaose (Gb5)-Strukturen zu synthetisieren. Das GM1-Oligosaccharid ist der Zelloberflächenligand des Choleratoxins. Globopentaosen kommen ausschließlich auf der Oberfläche von Krebszellen vor und sind somit vielversprechende Angriffspunkte bei der Entwicklung von Impfstoffen gegen Krebs. Sowohl GM1os und Gb5 können durch chemische als auch chemisch- enzymatische Ansätze hergestellt werden, was allerdings kostspielig und mühsam ist und daher nicht für eine Produktion in großem Maßstab geeignet ist. Der zytoplasmatische Weg, wie in diesem Projekt beschrieben, ist viel einfacher, billiger und skalierbarer. Die Kombination von maßgeschneiderten Glykanbiosynthesewege mit multivalenter Glykanpräsentation, wie in diesem Projekt geplant, erlaubt die vereinfachte Produktion von Choleratoxininhibitoren mit hoher Affinität sowie von multivalenten Gb5-Impfstoffkandidaten gegen Krebs.

Im Projekt "Engineering multivalenter Proteinglykosilierung in Escherichia coli: Verbesserte Glykanbindungswechselwirkungen und Therapeutika der nächsten Generation", wurde ein künstliches Proteinglykosilierungssystem weiterentwickelt, das im Zytoplasma des biotechnologischen Nutztieres E. coli abläuft. Ziel des Projektes war die Entwicklung neuartiger multivalenter Glykokonjugate die zur Anwendung als antipathogene Wirkstoffe kommen sollen. Multivalenz ist hierbei ein wesentliches Merkmal vieler Glykanbindungswechselwirkungen und stellt für die Erzeugung von zukünftigen Therapeutika eine entscheidende Eigenschaft dar. Die Grundlage des Glykosilierungssystems ist eine kürzlich entdeckte, bakterielle, Asparagin-Glykosyltransferase, die die spezifische Modifikation mit einer einzigen Glukose durchführt. Im Labor von Prof. Markus Aebi (ETH Zürich) konnten mehrere Glykosilierungsstellen bei verschiedenen Proteinen eingebaut werden, und so wurde eine kontrollierte multivalente Präsentation der Glykane erreicht. Ein Hauptziel dieses Projektes war die Entwicklung neuer künstlicher Glykanbiosynthesewege. Dafür wurden jene Gene in E. coli eingeführt, um entweder Fukosyllaktose oder Globotriosestrukturen im Zytoplasma des Bakteriums zu synthetisieren. Fukosyllaktose ist ein humaner Zelloberflächenligand des Choleratoxins, Globotriosen sind bekannte Bindungspartner des Shigatoxins. Sowohl Fukosyllaktose als auch Globotriosen können durch chemische und chemisch-enzymatische Ansätze hergestellt werden, was allerdings kostspielig und mühsam ist und daher nicht für eine Produktion in großem Maßstab geeignet ist. Der zytoplasmatische Weg, wie in diesem Projekt ausgenutzt, ist einfacher, billiger und skalierbarer. Die Kombination der neuen künstlichen Synthesewege mit der multivalenten Präsentation der Glykane führten so zur vereinfachten Produktion von hoch affinen Cholera- und Shigatoxininhibitoren, die zur Behandlung beider Infektionen verwendet werden könnten.