Rekombinante Allergene aus Tabakwurzelzellkulturen

Molecular farming beschreibt eine Technik zur Produktion von pharmazeutisch wichtigen und kommerziell verwertbaren Proteinen in Pflanzen oder pflanzlichen Zellkulturen. Die auf pflanzlichen Organismen basierende heterologe Expression von Fremdproteinen hat gegenüber tierischen und bakteriellen Expressionssystemen wichtige Vorteile: einfache und kostengünstige Massenproduktion, richtige Eukaryonten-spezifische post-translationale Modifikation der Proteine (Glykosilierung, Phosphorylierung, etc.), kein Risiko der Verunreinigung mit Viren, Onkogenen, Prionen und bakteriellen Toxinen, korrekte Faltung und Zusammenbau von Proteinmultimeren, kostengünstige Weiterverarbeitung, Expression mehrerer transgener Proteine und schließlich entstehen keine ethischen Probleme wie bei transgenen Tieren und in der Öffentlichkeit ist eine höhere Akzeptanz vorhanden. In den letzten Jahren wurden einige Fremdproteine erfolgreich in unterschiedlichen Pflanzenspezies (Tabak, Soja, Kartoffel, Arabidopsis) exprimiert, unter anderem rekombinante Antikörper und Antikörperfragmente, humane Interleukine, ß-Glucuronidasen, etc. In Abhängigkeit vom exprimierten Protein und dem Pflanzensystem konnten bis zu 500 g rekombinantes Protein pro Gramm Pflanzengewebe hergestellt werden und die Kosten waren im Vergleich zu transgenen Säugerzellkulturen oder transgenen Ziegen (1.000 - 10.000 US$ pro Gramm Protein) sehr gering, nämlich unter 25 US$ pro Gramm Protein! Durch diese kostengünstige Produktion ermöglicht die "molecular farming" Strategie neue Therapieformen, die vorher für den täglichen, klinischen Einsatz einfach zu teuer waren, z.B. die Produktion von Tumor-spezifischen Antikörpern für die Krebstherapie oder rekombinante Allergene für die verbesserte Diagnose und Therapie von Allergien. Der Einsatz rekombinanter Allergene in der klinischen Diagnose oder der spezifischen Immuntherapie, wie er von Allergologen vorgeschlagen wurde, kann aber nur dann realisiert werden, wenn die benötigten Mengen der rekombinanten Allergene kostengünstig hergestellt werden. Ebendies ermöglicht "molecular farming". Bisherige Ergebnisse mit der Expression des Pollenallergens Art v 1 von Beifuß in transgenen Tabakpflanzen waren Erfolg versprechend, sodass in weiterer Folge eine allgemeine Strategie zur Produktion pflanzlicher Allergene in Pflanzenzellkulturen geplant ist, die eine Produktion unter GMP-Bedingungen erlauben. Dabei ist zu bedenken, dass die nachfolgende Reinigung der rekombinanten Proteine der kostenintensivste Faktor ist. Somit können die Produktionskosten durch eine vereinfachte Reinigungsprozedur drastisch gesenkt werden. Für dieses Projekt werden transgene pflanzliche Wurzelzellkulturen aus Tabak hergestellt, die das Pollenallergen Art v 1 und/oder das Latexallergen Hev b 2 überexprimieren und zwar so, dass das rekombinante Proteine über den sekretorischen Pfad in das Kulturmedium ausgeschleust wird; eine Möglichkeit zur Senkung der Kosten für die Aufreinigung. Parallel dazu wird ein fluoreszierendes Protein durch die gleichen zellulären Mechanismen von der Zelle sezerniert (Produktionsmarker), sodaß die gemessene Fluoreszenz im Kulturmedium den Produktionsstatus der Kultur widerspiegelt. Zusätzlich werden die rekombinanten Allergene mit einer abspaltbaren Markierung (tag) versehen, um die Aufreinigungskosten weiter zu senken. Schlussendlich werden die immunologischen Eigenschaften des gereinigten, aus Pflanzenzellkulturen produzierten Allergens mit denen des nativen und eines aus bakteriellen Kulturen produzierten Allergens mittels Patientenseren charakterisiert, um ihre Eignung für die Diagnose oder Therapie für Allergien zu überprüfen. Die Hauptziele des Projektes sind (i) die Optimierung und Verbesserung der kostengünstigen "molecular farming" Strategie für den späteren Transfer zu Biotechnologiefirmen, (ii) die Entwicklung von kostengünstigen Aufreinigungschritten, um den Gebrauch von rekombinanten Allergenen in der klinischen Anwendung erst zu ermöglichen und (iii) eine realistische Grundlage für die Profit-Kostenkalkulation für die spätere industrielle Produktion zu schaffen.