Spektroskopische Methoden für die Bioprozessoptimierung

In der Biotechnologie wird Escherichia coli häufig in der Produktion rekombinanter therapeutischer Proteine eingesetzt, da die Physiologie dieses Bakteriums bereits gut erforscht ist und man es genetisch leicht manipulierbaren kann. Wird allerdings E. coli dazu gebracht Fremdprotein in hoher Konzentration zu produzieren, wird das gewünschte Produkt allerdings meist nicht in löslicher Form produziert, sondern in Form von inaktiven Einschlußkörpern, sog. Inclusion Bodies, in der Bakterienzelle deponiert. Bis vor kurzem wurde dies als großer Nachteil dieser Produktionsmethode angesehen, da das aktive Protein aus diesen Einschlußkörpern durch aufwendige, meist nur durch Empirie entwickelte Methoden gewonnen werden muss. Der Verlusten an Produkt ist dabei meist sehr groß. Nun wird allerdings die Deponierung des Zielproteins in Inclusion Bodies (IBs) mehr und mehr als Chance erkannt, weil auf diese Weise von Bakterienzellen riesige Mengen an interessanten Proteinen produziert werden können und IBs einfach zu gewinnen sind. Zudem zeigten spektroskopische Untersuchungen, dass die Zielproteine in IBs bereits Strukturmerkmale haben wie die Zielproteine in ihrer aktiven Form. Die Herausforderung besteht nun darin, dass die dreidimensionale Struktur des IB Proteins durch physikalische und/oder chemische Einflüsse so verändert wird, dass ausschließlich die für die biologische Aktivität nötige Struktur entsteht. Effiziente Bedingungen, die dies ermöglichen, würden die Produktausbeute drastisch erhöhen. Dazu ist es allerdings notwendig die Proteinstruktur im gesamten Produktionsprozess zu analysieren und Bedingungen, die falsche Faltungszustände und Aggregation forcieren, zu vermeiden.. Dies verlangt den Einsatz einer ganzen Palette moderner spektroskopischer Verfahren, da Proteinstrukturen in verschiedensten Aggregatzuständen analysiert werden müssen: Fourier-Transform-Infrarot Spektroskopie (FTIR), Abgeschwächte Totalreflexions-FTIR-, Schwingungs-Circular Dichroismus- (VCD), Eletronische Circular Dichroismus-, Fluoreszenz- und UV-Vis Spektroskopie. Der umfassende Einsatz dieser Techniken in der begleitenden Analyse des gesamten Produktionsprozesses wird erstmalig in einem Projekt anhand von drei Modellproteinen (Meerettich Peroxidase, Interleukin-2, und ß-Lactamase) untersucht. In parallelen Untersuchungen werden die produktiven (reversiblen) und unproduktiven (irreversiblen) Faltungswege und zustände dieser 3 Proteine mittels schneller Messtechniken erfasst und diese Information wiederum in der Etablierung effizienterer Faltungsprotokolle genutzt. Ziel ist es letztendlich die Ausbeute an bioaktivem Produkt erheblich erhöhen werden.