Glukose Biosensor basierend auf Cellobiose Dehydrogenase

Die quantitative Bestimmung von Glukose, einer der wichtigsten Metaboliten, hat zahlreiche Anwendungen in der Lebensmittel- und Biotechnologie, sowie der Medizin. Angetrieben durch den enormen Umsatz von 6,1 mrd. $ weltweit (2004) für Blutzuckermeßgeräte sind Glukose-Biosensoren Gegenstand intensiver Forschung. Durch die Etablierung eines direkten Elektonentransfers vom Biokatalysator zur Elektrode könnten einige der Probleme der herkömmlichen amperometrischen Glukose-Biosensoren gelöst werden. Ein Enzym, das die geforderte Eigenschaft des direkten Elektronentransfers aufweist, ist die Cellobiose-Dehydrogenase (CDH), ein extrazelluläres Flavohaemenzym aus Pilzen. Bisher konnte es aus zwei Gründen nicht zur Detektion von Glukose eingesetzt werden: es setzt aufgrund der Substratspezifität Glukose nur sehr langsam um und weist ein saures pH- Optimum auf, das Messungen in neutralen oder alkalischen Proben wie z.B. Blut nicht zulässt. Die kürzlich im thermophilen Ascomyceten Myriococcum thermophilum entdeckte CDH unterscheidet sich in einigen Aspekten von den gut untersuchten Basidiomyceten CDHs. Das Enzym kann Glukose sehr gut umsetzen, auch bei einem etwas höherem pH-Wert. Im Versuch mit einer CDH-modifizierten Elektrode lag das Detektionslimit für Glukose bei 1 mM (pH 5,0), der physiologisch relevante Bereich ist 2-50 mM. Um den Glukose-Biosensor zu verbessern und kommerziell erfolgreich einzusetzen, muß die intramolekulare Elektronentransferrate der M. thermophilum CDH welche die direkte Elektronentransferrate bei neutralem und alkalischem pH beschränkt, erhöht werden. Die Strategie dazu liegt in der Aufklärung des überaus effizienten intramolekularen Elektronentransfermechanismus von T. villosa CDH und der Übertragung ihrer Eigenschaften auf M. thermophilum CDH durch Punktmutationen. Zur Steigerung des Elektronentransfers bei höheren pH-Werten wurden Mutationspositionen aus Homologiemodellen bekannter Sequenzen, besonders der CDH des Ascomyceten H. insolens, welche ein alkalisches pH-Optimum aufweist, gewonnen. Es ist geplant, daß nach der Herstellung und Reinigung der Enzymvarianten diese biochemisch auf verbesserte Interaktion der Domänen (kinetisch und thermodynamisch) und bioelektrochemisch mittels geeigneten Elektroden auf verbesserten direkten Elektronentransfer geprüft werden. Um diese interdisziplinäre Aufgabe zu bewältigen zu können, sollen die beiden vorgeschlagenen jungen Wissenschaftler durch Diplomanden in ihrer Arbeit unterstützt werden. Zusätzlich wird eine Kooperation verschiedener Fachbereiche wie Molekularbiologie, Biochemie, Strukturchemie und Elektrochemie, vertreten durch nationale und internationale Kooperationspartner vorgeschlagen.

Die schnelle und sichere Bestimmung der Glukosekonzentration im Blut ist eine unangenehme Notwendigkeit für Diabetespatienten. Eine Vereinfachung und Erleichterung kann durch schmerzfreie Messmethoden, wie der Applikation eines miniaturisierten, kontinuierlich arbeitenden Glukosesensors erreicht werden. Die derzeitigen Sensoren arbeiten allerdings nur ca. 1 Woche. Kontinuierliche Glucosesensoren können wesentlich häufiger und genauer Glukosebestimmungen vornehmen, was eine genauere Dosierung von Insulin ermöglicht. Um einen verbesserten kontinuierlichen Glucosesensor zu entwickeln wurde in dieser Studie ein neues Enzym, die Cellobiosedehydrogenase (CDH), untersucht. Dieses Enzym kann die erhaltenen Elektronen aus der Oxidationsreaktion mit Glukose direkt auf die Elektrode übertragen und benötigt keine Redoxmediatoren wie die herkömmlichen Enzyme Glukoseoxidase oder Glukosedehydrogenase. Sensoren die auf dem Prinzip des direkten Elektronentransfers aufbauen, benötigen weniger und billigere Sensorkomponenten und sind daher einfacher und billiger herstellbar. Zusätzlich können sie schneller (und dadurch öfter) messen, da die Versorgung des Senors mit Glukose nicht durch schwer durchdringbare Redoxpolymere oder Membranen gehemmt wird. Für diese Anwendung wurden geeignete CDHs in einem Screening von Pilzen gesucht und zwei CDHs, eine aus Myriococcum thermophilum die andere aus Corynascus thermophilus genauer charakterisiert. Die Schwierigkeit der Anwendung der CDH unter physiologischen Bedingungen lag in der Adaption von ihrem ursprünglich saurem pH- Optimum an einen pH von 7.4 (dem pH-Wert von Blut). Die CDH aus M. thermophilum wurde durch strukturbasierte, gerichtete Mutagenese an den pH-Wert von 7.4 angepasst. Dazu wurde ein Model der Enzymstruktur errechnet, geeignete Aminosäuren für die Mutagenese bestimmt und das Enzym entsprechend mutiert. Die so erhaltenen Enzymvarianten wurden gereinigt und charakterisiert. Durch die Kombination von (bis zu 7) Mutationen was das Enzym in der Lage den Elektronentransferprozess zur Elektrode bei physiologischem pH-Wert sehr schnell durchzuführen. Um die ungewünschte Nebenreaktivität mit Maltose welche die exakte Glukosebestimmung negativ beeinflussen könnte zu unterbinden, wurde das katalytische Zentrum der M. thermophilum CDH ebenfalls durch Mutagenese verändert und der Maltoseumsatz unterbunden. In einer ersten Studie konnte anhand der nicht-modifizierten CDH aus C. thermophilus gezeigt werde, dass eine Realisierung eines Glukosebiosensors mit diesem Enzym sehr wohl möglich ist. Das erreichte Detektionslimit für Glukose liegt bei 0.05 mM, der lineare Messbereich beit 0.1 bis 30 mM und die Sensitivität bei 222 nA M -1 cm-2 . Die genetisch modifizierte CDH aus M. thermophilum zeigt noch bessere Eigenschaften und wird in Kürze auf ihre Anwendbarkeit überprüft werden.