Identifikation von Biomarkern durch Sekretom-Analysen

Das maligne Melanom ist eine hochgradig maligne Entartung der Melanozyten. Der Tumor neigt dazu, früh Metastasen über Lymph- und Blutbahnen auszubilden, die mit einer schlechten Prognose einhergehen. Eine frühzeitige Detektion reduziert die Mortalität signifikant. Wir haben neue Strategien zur Identifikation frühzeitiger Biomarker etabliert, welche auf der Analyse von Protein- und Sekretions-Profilen gereinigter primärer Zellen basiert. Das Tumor-assoziierte Stroma ist in der Lage, durch die Ausschütting von Wachstums- und Überlebensfaktoren stark Tumor-promovierend zu wirken. Diese Kooperativität der Zellen ist reversibel und daher gut für therapeutische Interventionen zugänglich. Zusätzlich scheinen diese charakteristischen Veränderungen des Stromas der Tumorprogression vorauszugehen. Spezifisch sezernierte Proteine können daher als frühe Biomarker dienen. Aufgrund der erhöhten Durchlässigkeit neu formierter Blutgefäße und des erhöhten hydrostatischen Drucks im Tumor ist es naheliegend, dass sezernierte Proteine in das Blutsystem gelangen und dort mittels ELISA detektiert werden können. Wir haben bereits charakteristische Aberrationen Melanom-assoziierter Fibroblasten gefunden sowie Kandidaten für Biomarker mittels Massenspektrometrie identifiziert. Der vorliegende Antrag basiert auf auf drei unterschiedlichen Modell-Systemen, kultivierte Zelllinien, Tiermodelle sowie klinisches Probenmaterial vom Menschen. Aus diesen Modell-Systemen werden wir auf die selben Zelltypen Bezug nehmen und mit Hilfe eines bestehenden Datenbank-Systems in der Lage sein, den Einfluss des Tumor-assoziierte Stromas im Detail herauszuarbeiten. Mittels Ko-Kulturen können wir in vivo Interaktionen von Tumorzellen und Stromazellen vor und nach der Metastasierung nachahmen. Die hier gewählte Strategie wird es ermöglichen, diagnostische Biomarker zur Früherkennung von metastasierendem Melanom zu identifizieren und durch ein verbessertes Verständnis zugrunde liegender pathophysiologischer Mechanismen neue therapeutische Strategien zu entwickeln.

Ziel dieser Studie war die Identifikation von neuen Biomarkern für das Melanom. Eine starke Motivation war die Beobachtung, dass genetisch unveränderte Stromazellen aus der unmittelbaren Umgebung von Melanomzellen funktionell verändert sind, was eine veränderte Sekretion von Proteinen bedingen könnte. Eine entsprechend veränderte Sekretion solcher Zellen aus menschlichem Melanom-Gewebsproben wurde in diesem Projekt eingehend evaluiert und einige Biomarker-Kandidaten erfolgreich identifiziert. Die wesentliche technische Herausforderung war die Isolation und Analyse von sezernierten Proteinen aus primären Zellen in repräsentativer Weise. Dazu haben wir ein eigenes Labor Management-System entwickelt, welches alle Analysenschritte und (Zwischen-)Resultate vollständig dokumentiert. Dadurch unterstützt haben wir umfassende systematische Studien über die Spezifität von sezernierten Proteinen in Abhängigkeit vom funktionellen Zustand der Zellen durchgeführt. Zu diesem Zweck behandelten wir normale Hautfibroblasten mit dem entzündlichen Zytokin Interleukin 1-beta. Die damit herausgearbeitete funktionelle Signatur unterstützte die Interpretation der Resultate mit den primären Melanom-assoziierten Fibroblasten. Für eine weitergehende systematische Analyse haben wir auch Gewebs-Fibroblasten aus menschlichem Knochenmark, Leber und Lunge analysiert. Alle Daten wurden mittels einer eigenen Datenbank erfasst und evaluiert.Eine Analyse mittels nano-Fluss Flüssigchromatographie gekoppelt an ein Ionenfallen-Massenspektrometer ergab typischerweise mehr als 100 verschiedene Protein-Identifikationen von tatsächlich sezernierten Proteinen. Diese enthielten extrazelluläre Matrixproteine, Zytokine, Wachstumsfaktoren und andere biologisch wichtige Signalmoleküle. So konnten wir eine charakteristische Signatur für entzündliche Aktivierung festlegen und auch in Tumor-assoziierte Fibroblasten evaluieren. Hier konnten wir deutliche Unterschiede in Abhängigkeit vom Tumor-Typ als auch von Individuen feststellen. In einem weiteren Schritt wurde untersucht, ob ausgewählte Marker-Proteine in Melanompatienten in erhöhten Konzentrationen vorliegen. Nach der Einholung eines positiven Ethik-Votums konnten wir mehr als 100 Serum-Proben von Melanom-Patienten und anderen Hauterkrankungen als Kontrollen sammeln. Im Rahmen einer Kooperation mit dem Institut für Immunologie wurden für vier ausgewählte Markerproteine ELISA- und Luminx-Assays evaluiert, welche aber aufgrund der niedrigen Konzentrationen zu keinen auswertbaren Ergebnissen führten. Derzeit entwickeln wir Massenspektrometrie-basierende Assays (multiple reaction monitoring) für diese Proteine, welche die erforderliche Empfindlichkeit und Robustheit in Bezug auf Matrixeffekte aufweisen können.