Humanes RIP1 in Hefe: Ein Hochdurchsatz-Modell für Nekrose

Nekrose wurde lange Zeit als eine passive Zelltodform betrachtet, d.h. als eine Zelltodart, die scheinbar keine definierten Regulatoren benötigt. Allerdings deuten umfangreiche Studien in den letzten Jahren explizit auf die Existenz von Genen hin, die den Ablauf der Nekrose kontrollieren. Dazu gehört das erste als molekularer Nekroseregulator beschriebene Receptor-Interacting-Protein (RIP), eine Serin-Threonin-Kinase, die Nekrose als Antwort auf letale Reize (Zytokine, DNA-Schäden etc.) einleitet. Die funktionelle Charakterisierung von RIP suggerierte erstmals die Existenz einer programmierten Form des nekrotischen Tods und führte somit zu einem Paradigmenwechsel im Feld des programmierten Zelltods: Nekrose kann nicht nur unreguliert als Folge einer extrem schädigenden Einwirkung stattfinden, sondern kann auch, ähnlich wie Apoptose, in orchestrierter (also programmierter) Form ablaufen. Berücksichtigt man die Prävalenz der Nekrose als Antwort auf pathologische Bedingungen, so wird der Fortschritt dieses Forschungsbereichs und das damit verbundene Bestreben, den molekularen Mechanismus der Nekrose zu verstehen, tiefgreifende Folgen für die menschliche Gesundheit und die Aufklärung vieler Krankheiten haben. Die Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) hat sich im letzten Jahrzehnt zu einem beliebten Modellorganismus zur Untersuchung molekularer Zelltodmechanismen entwickelt. Hefezellen verfügen über ein Zelltodprogramm, das in höheren eukaryontischen Zellen in ähnlicher Form vorhanden ist. So findet man im Hefesystem viele orthologe pro-apoptotische Moleküle wieder, wie z.B Caspasen, Endonuklease G und AIF (apoptosis-inducing-factor). Dabei finden bei der Ausführung dieses Programms verschiedene spezifische voneinander trennbare Formen oder Subroutinen des programmierten Zelltods statt. Diese hohe Konservierung molekularer Regulationsmechanismen erlaubt es, S. cerevisiae als Modellsystem für Säugerzellen heranzuziehen, um die Rolle verschiedener subzellulärer Prozesse des programmierten Zelltodes, wie etwa der Funktionen der Mitochondrien oder des Lipidmetabolismus, zu untersuchen. Zudem bietet Hefe entscheidende technische Vorteile gegenüber anderen Modellsystemen: so erlauben einfache Plattierungsassays eine genaue Angabe der Überlebensrate einer Kultur, etwa in einer Nekrose- induzierenden Umgebung. Außerdem ermöglichen weitere, bereits etablierte zelltodspezifizierende Techniken eine genaue Identifizierung der vorhandenen Zelltodart (Apoptose, primäre Nekrose, sekundäre Nekrose). Im Gegensatz zu Säugerzellen können Hefezellen ohne funktionierende Mitochondrien, denen in immer mehr Studien eine entscheidende Rolle bei der Ausführung des Todesprozesses zugeschrieben werden, überleben und stellen somit ein geeignetes Modell zur Erforschung der mitochondrialen Funktion beim Zelltod dar. Hefe verspricht also für die Nekroseforschung zu einem ebenso wichtigen Modellorganismus zu avancieren, wie es das bereits im Gebiet der Apoptose ist. Unsere bisherigen Daten zeigen, dass die heterologe Expression von RIP1 in S. cerevisiae, trotz des Fehlens eines Hefe-RIP1-Orhtologs, eine wichtige Rolle in der Regulation von Hefenekrose spielt. Dies deutet daraufhin, dass mutmaßliche Substrate oder Interaktoren der RIP1-Kinase in Hefe konserviert sind, folglich könnten RIP1- Expressionsstudien in S. cerevisiae wichtige Einblicke in die Funktion und die Effekte dieser Kinase in menschlichen Zellen verschaffen. Heterologe Expressionsstudien haben bereits ihr Potential in der Aufklärung vom Ablauf des programmierten Zelltods in Säugerzellen gezeigt, etwa im Bereich der Bax-vermittelten Apoptoseinduktion. Basierend auf unseren Ergebnissen mit RIP1 wollen wir ein Hefemodell zur Erforschung der programmierten Nekrose etablieren und sowohl genetische als auch metabolische Analysen vornehmen, die Nekroseregulatoren identifizieren und regulatorische Mechanismen beschreiben sollen. Wir möchten die letalen Effekte der heterologen Expression von menschlichem RIP1 charakterisieren und die entsprechenden Nekrose-regulierenden Gene (Förderung und Hemmung) identifizieren. Dabei sollen mittels Immunpräzipitationen Interaktoren von RIP1 isoliert und näher analysiert werden. Parallel dazu sollen Lipid- bzw. Membrananalysen der RIP1-exprimierenden Zellen durchgeführt werden, um potentielle Biomarker oder Verstärker der Nekrose zu ermitteln. Dies würde erstmals die Veränderungen des Lipidstoffwechsels in nekrotischen Zellen beschreiben. Mein langfristiges Ziel ist es letztlich, die im Hefemodell gewonnenen Erkenntnisse über den Ablauf der regulierten Nekrose, auf Säugerzellen zu übertragen. Insgesamt haben die