Eisen Regulation und Virulenz in Aspergillus fumigatus

Pilzinfektionen sind jährlich für 1.5-2 Millionen Todesfälle verantwortlich, daneben beinträchtigen Pilze die Lebensqualität durch nicht-lebensbedrohliche Infektionen, zum Beispiel der Haut, sowie durch das Auslösen von Allergien. Aspergillus fumigatus ist ein Schimmelpilz, der typischerweise auf totem organischem Material als Saprophyt zu finden ist. Für immunsupprimierte Patienten ist dieser Pilz allerdings einer der gefährlichsten pilzlichen Krankheitserreger. Die Entwicklung von Resistenzen gegen herkömmliche antifungale Medikamente macht die Entwicklung neuer Antimykotika notwendig. Vorhergehenden Studien zeigten dass die pilzliche Eisenhomöostase eine wichtige Rolle in der Pathogenität von A. fumigatus spielt. Eisen ist zwar ein essentieller Co-Faktor für viele zelluläre Prozesse, aber Eisen ist im Überschuss ein Zellgift. Ein Schlüsselregulator der Eisenhmöostase von A. fumigatus, entdeckt und charakterisiert durch die Arbeitsgruppe von Prof. Haas, ist der Transkriptionsfaktor HapX. Einerseits reguliert HapX die Adaption an Eisenmangel durch Verringerung des Eisenverbrauchs und Aktivierung von Eisenaufnahme durch Siderophore. Andererseits ist HapX auch für die Eisenresistenz verantwortlich indem es bei Eisenüberschuss zur Aktivierung von Eisendetoxifizierung durch Speicherung in der Vakuole essentiell ist. Die Abschwächung der Virulenz von A. fumigatus im Tiermodell durch Verlust von HapX oder Siderophor-vermittelter Eisenaufnahme zeigt, dass eine effiziente Adaptation an Eisenmangel eine wichtige Rolle in der Pathogenität spielt. Trotz zahlreicher rezenter Erkenntnisse, sind viele Aspekte der Anpassung an Eisenmangel noch ungeklärt. In dem beantragten Projekt sollen neue Komponenten der zellulären Maschinerie zur Adaption an Eisenmangel identifiziert werden. Dazu wird ein Screening von A. fumigatus Mutanten denen Gene für Trankriptionsfaktoren, Kinasen, oder Phosphatasen fehlen, durchgeführt. Das heißt, das Screening zielt auf die Aufklärung der Regulation der Eisenmangelantwort. Das Screening inkludiert verschiedene, zum Teil neu etablierte Selektionsverfahren. Vielversprechende Kandidaten aus dem Screening werden dann einer detaillierten Charakterisierung unterworfen um die Funktion des fehlenden Genproduktes aufzuklären. Des Weiteren, wird die Funktion des Genproduktes in der Virulenz mit in vitro und in vivo Analysen untersucht um die Identifizierung neuer Ziele für die Entwicklung neuer Antimykotika zu gewährleisten.

Ziel dieses Forschungsprojekts war es, Einblicke in die Eisenregulation und den Eisenstoffwechsel im pathogenen Pilz Aspergillus fumigatus, einem der wichtigsten menschlichen Pilzerreger, zu gewinnen, um neue Angriffspunkte für antimykotische Therapien zu finden. Das Projekt konzentrierte sich auf das Screening einer Stammsammlung von Deletionsmutanten, die Charakterisierung ausgewählter Stämme und die Vervollständigung der Sammlung mit konditionell-letalen Mutanten. Darüber hinaus sollten Gene identifiziert werden, die an der Pathogenität beteiligt sind, und die Möglichkeit spezifischer Hemmstoffe untersucht werden. Das Projekt begann mit der Entwicklung zuverlässiger Screening-Strategien zur Identifizierung eisenbezogener Defekte in A. fumigatus-Mutanten. Drei Screening-Methoden wurden optimiert, und etwa 40 Stämme, die eisenbedingte Defekte aufwiesen, wurden ausgewählt, um weiter charakterisiert zu werden, um ihre Beteiligung am Eisenstoffwechsel zu verstehen. Ein weiteres Ziel des Projekts war die Vervollständigung der Kinasemutanten-Stammsammlung mit konditionell-letalen Mutanten. Da jedoch eine detaillierte Untersuchung der verfügbaren induzierbaren Promotoren erforderlich war, wurde die Sammlung stattdessen mit Histidinkinase-Deletionsmutanten ergänzt. Die Untersuchung induzierbarer Promotoren führte zur Entwicklung neuer molekularer Werkzeuge, einschließlich induzierbarer Selektionsmarker und eines modularen induzierbaren Multigenexpressionssystems. Die Untersuchungen zum Pathogenitätspotenzial umfassten vorläufige Zellschädigungstests und In-vivo-Studien mit der großen Wachsmotte Galleria mellonella. Das murine Modell für invasive Aspergillose war für spätere Phasen geplant, falls interessante Stämme identifiziert würden. Aufgrund der verkürzten Projektdauer werden diese Experimente dank der Unterstützung durch die Kollaborationspartner noch immer durchgeführt. Im Laufe des Projekts wurden mehrere wichtige Ergebnisse erzielt, z. B. wurden bei der Untersuchung induzierbarer Selektionsmarker bisher unbekannte unerwünschte Wirkungen bei der Verwendung solcher Marker festgestellt, was zur Entwicklung neuer selektierbarer Markerkassetten führte. Darüber hinaus wurde ein modulares induzierbares Multigenexpressionssystem optimiert, das die unabhängige Verwendung von bis zu drei induzierbaren Promotoren in einem einzigen Stamm ermöglicht, ein Werkzeug, das im industriellen Bereich stark genutzt werden kann. Darüber hinaus konnten dank der entwickelten Screening-Strategien einige mutierte Stämme identifiziert und weiter charakterisiert werden, von denen einige bereits in unabhängigen wissenschaftlichen Arbeiten als relevant für die Pathogenität beschrieben wurden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Forschungsprojekt wertvolle Einblicke in die Regulation der Eisenhomöostase und potenzielle antimykotische Zielproteine in A. fumigatus geliefert hat. Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Pathogenese des Pilzes bei und eröffnen Wege für die Entwicklung neuer antimykotischer Therapien.