Discontinuous group II intron RNAs and their potential in intermolecular splicing

Gruppe II Introns, wie sie in Bakterien und in Zellorganellen niederer Eukaryonten und Pflanzen gefunden wurden, sind in vitro selbstspleissend, d.h. die in komplexer Weise gefaltete Intron-RNA katalysiert ihre eigene Exzision aus der prä-RNA sowie die Ligation der flankierenden Exons. Mehreren (Sub-)Domänen dieser Introns sind Teilfunktionen des Spleissprozesses zugeordnet worden, und es gibt erste Hinweise, daß diese auch in trans wirksam werden können. Insbesondere haben wir in Vorversuchen zu diesem Projekt gezeigt, daß die für die Erkennung des 5Exons essentielle Intron-Subdomäne D3 als separate RNA mit dem D3-losen Hauptteil des Introns bI1 assoziieren und diesem die Exon-Erkennungsfunktion vermitteln kann. Solche Beobachtungen zur möglichen Fraktionierung von Gruppe II Introns haben früheren Hypothesen Auftrieb gegeben, daß diese Introns die phylogentischen Vorläufer der ubiquitären Introns prä-mRNA kodierender Gene der Eukaryonten sein könnten. Das Spleißen solcher Introns wird in trans von snRNAs, die assoziierten Proteinen das Spleissosom ausmachen, katalysiert. Versuchsweise lassen sich beim heutigen Wissensstand einzelne (Sub- )Domänen der Gruppe II Introns mit snRNAs homologisieren, etwa D3 und US snRNA. Wir wollen hier eine Reihe von (Sub-)Domänen von Gruppe II Introns auf ihre Fähigkeit zur Komplementierung partiell deletierter Rest-Introns hin untersuchen und so in vitro eine Reihe von trans-aktiven RNAs charakterisieren. Insbesondere wollen wir prüfen, wieweit das in cis verbleibende Intron verkürzt werden kann, und wieviele trans-aktive RNAs miteinander und mit dem Rest-Intron in der Prä-RNA funktionell interagieren können. (Sub-)Domänen verschiedener Introns, aber auch spleissosomale snRNAs werden in diesen in vitro Spleißversuchen eingesetzt werden. Weiterhin werden wir die für die Komplementation in trans wichtigen Sequenzbereiche dieser RNAs charakterisieren und damit die Grundlage legen für Studien zur 3-D Struktur einzelner (Sub-)Domänen von Gruppe II Introns. Diese in vitro Studien mögen dazu beitragen, die Funktionsweise in vivo existierender, fragmentierter Gruppe II Introns, insbesondere der Gruppe m Introns von Euglena gracilis zu klären und den Weg von der RNA-Katalyse in cis zur RNA-Katalyse in trans bis hin zum Spleissosom nach zu zeichnen. Wir erhoffen uns eine weitere Klärung des katalytischen Potentials der Gruppe II Introns, die Entdeckung neuer Transesterifizierungsreaktionen und die Gewinnung kleiner, leicht handhabbarer katalytischer RNAs.