Single Molecule Detection and Tracking in the Near-Infrared:Solution to the Background Problem in Ultrasensitive Biological Microscopy

Die Zielsetzung dieses Forschungsprojektes war, die Einzelmolekülmikroskopie auf lebende Systeme anwendbar zu machen. Grundvoraussetzung für die experimentelle Erfassung dynamischer Prozesse auf Einzelmolekülebene in lebenden Zellen ist es, die Autofluoreszenz, eine Eigenschaft der Zelle unter Laserbestrahlung selbst zu fluoreszieren, zu minimieren. Durch Verwendung von Laserquellen im nahen Infrarot sowie der Auswahl geeigneter Fluoreszenzfarbstoffe, ist unserer Arbeitsgruppe im Rahmen dieses Projektes die erstmalige Untersuchung zellulärer Prozesse auf der Ebene der einzelnen daran beteiligten Moleküle gelungen. Damit ermöglicht diese speziell entwickelte Technik nicht nur, einzelne Proteine und Lipide auf Zellen zu detektieren, sondern zusätzlich ihre Dynamik zu studieren. In einer ersten Untersuchung der Dynamik einzelner Moleküle in lebenden Zellen studierten wir die Beweglichkeit einzelner fluoreszenzmarkierter Lipide in der Plasmamembran menschlicher Muskelzellen. Die dabei gewonnenen Ergebnisse bestätigten, dass das bislang gültige Bild einer homogenen Lipidmatrix nur eingeschränkt gültig ist. Es zeigte sich, dass die Membran-Lipide scharf abgegrenzte Domänen ausbilden, welche eine Größe von bis zu 500nm aufweisen. Solche Domänen waren zwar in der Fachliteratur postuliert, konnten allerdings bis zu dieser Studie noch nicht direkt visualisiert werden. Der Zugang über Einzelmolekül-Mikroskopie erlaubt darüberhinaus eine Charkterisierung der Lipid-Mobilität sowohl innerhalb als auch außerhalb dieser Domänen. Solche Funktionsstudien zellulärer Komponenten werden am Endpunkt einer Entwicklung stehen, die mit der Aufklärung des menschlichen Genoms ihren Ausgang genommen hat. Während eine Aufklärung der Funktionsweise aller exprimierten Moleküle nur als Fernziel angesehen werden kann, ist der nächste Schritt nach der Kenntnis des Genoms die Aufklärung des Proteingehalts verschiederner Zellen. So ist nach wie vor in vielen Fällen unbekannt, welche Proteine von Zellen in welcher Menge hergestellt werden, bzw. wie diese Menge bei Krankheiten verändert wird. Der hier entwickelte Aufbau stellt infolge seiner hohen Sensitivität ein optimales Meßgerät für zukünftige Protein-Expressionsstudien dar. Dies wird insbesondere in der diagnostischen Medizin die Früherkennung von Krankheiten erleichtern. Die bestehende Apparatur wurde von Beginn an im Rahmen des "Schindler Memorial Center for Single Molecule Microscopy" den österreichischen Biowissenschaften für Zusammenarbeiten zur Verfügng gestellt. Darüberhinaus wurden zahlreiche internationale Zusammenarbeiten durch dieses Projekt ermöglicht.