Phospholipid remodeling and lipid signaling in the yeast, Saccharomyces cerevisiae - the role of phospholipases

Phospholipasen sind weit verbreitete Enzyme, die, worauf ihre Bezeichnung hinweist, die Hydrolyse von Phospholipiden katalysieren. Die physiologischen Funktionen von Phospholipasen sind höchst vielfältig. Sie sind beteiligt an der Verdauung extrazellulärer Phospholipide und am Abbau der Phospholipidmatrix "verbrauchter" zellulärer Membranen. Zu den komplexeren Funktionen intrazellulärer Phospholipasen zählt der Umbau (das Remodeling) vorgeformter Phospholipide im Zuge der Etablierung und Erhaltung des für eine bestimmte Membran typischen Phospholipidmusters. Sie sind beteiligt an der Produktion von Signalsubstanzen, wie Diacylglycerinen, Inositolphosphaten, dem Plättchen-aktivierenden Faktor (PAF) und von Eicosanoiden. Fehlregulationen in diesem Bereich können pathologische Prozesse auslösen, z.B. bei entzündlichen Erkrankungen. Unser Wissen um Details der Wirkungsweise von Phospholipasen, ihre Rolle bei essentiellen zellulären Prozessen, wie z. B. dem oben enwähnten Remodeling von Membtranlipiden, bei der Vesikel-abhängigen Sekretion von Proteinen oder der Fusion von Membranen, ist recht mangelhaft. Insbesondere über die Regulation der Aktivität von Phospholipasen ist erstaunlich wenig bekannt. Ohne strikte Kontrolle wären die in einer Zelle vorhandenen Phospholipasen in der Lage, zelluläre Membranen innerhalb kurzer Zeit aufzulösen. Im Rahmen des geplanten Projektes soll Hefe (Saccharomyces cerevisiae) als biochemisch und genetisch besonders leicht zu manipulierender Organismus verwendet werden, um Eigenschaften, Funktionen und Regulation von Phospholipasen zu studieren. Kenntnis des gesamten Hefegenoms ist hierbei von unschätzbarem Wert. Im Verlauf eines vorangegangenen Projektes wurden umfangreiche Daten über Vorkommen, Eigenschaften und Funktionen von Phopsholipasen der Hefe erhalten. Bisher nicht beschriebene Phospholipasen wurden charakterisiert, die Regulation einer Phospholipase auf der Stufe der Synthese des Enzyms wurde nachgewiesen und Mutanten, denen funktionelle Gene für bestimmte Phospholipasen fehlen, wurden hergestellt und teilweise charakterisiert. Das Remodeling von Phospholipiden wurde ebenfalls nachgewiesen. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen soll dieses Remodeling weiter untersucht werden. Welche Phospholipasen sind beteiligt? Dient es "nur" der Produktion bestimmter Phospholipide, welche die physikalischen Eigenschaften von Membranen rnitbestimmen, oder erfolgt Remodeling im Verlauf dynamischer Prozesse, z.B. bei der Biogenese von Membranen, dem intrazellulären Transport sekretorischer Vesikel oder der Produktion von Signalsubstanzen, die "nach Gebrauch" durch Resynthese zu intakten Phospholipiden inaktiviert werden? Wie werden Aktivitäten von Phospholipasen reguliert, und welche Auswirkungen auf zelluläre Prozesse hat das Ausschalten von Phospholipasen durch genetische Manipulation? Diese und weitere Untersuchungen der molekularen Eigenschaften und des Wirkungsmechanismus von Phospholipasen sollen zu einem besseren Verständnis der physiologischen Funktionen dieser lebenswichtigen Enzyme führen.

Phospholipasen sind ubiquitär vorkommende Enzyme, welche die Hydrolyse von Acylester - und Phosphodiester Bindungen von Glycerophospholipiden katalysieren. In höheren Eukaryonten haben Phospholipasen verschiedenste Funktionen, wie Verdauung extrazellulärer Phospholipide (z.B. im Darm), und Abbau intrazellulärer Phospholipide bei der Entsorgung "verbrauchter" Organellmembranen. Phospholipasen A2 , C und D sind Komponenten intrazellulärer Wege der Signalübertragung durch Agonist-induzierte Bildung von second messenger Lipiden. Phospholipasen sind beteiligt an der Synthese molekularer Spezeies von Glycerophospholipiden über einen Deacylierungs-Reacylierungs Mechanismus oder durch Austausch der Kopfgruppe. Auf diese Weise werden Bausteine für die Membran-Biogenese verfügbar. Weiters sind Phospholipasen Komponenten von Insekten- und Schlangengiften und sind beteiligt an der Virulenz infektiöser Candida Stämme. Im Rahmen dieses Projektes diente die Hefe Saccharomyces cerevisiae als Modellorganismus zum Studium der Rolle von Phospholipasen bei einigen der oben genannten zellulären Prozesse. Der Schwerpunkt lag bei der Untersuchung von Phopholiasen B, erstens weil über diesen Typ Phopholipasen, welche Glycerophospholipide vollständig und irreversibel deacylieren, sehr wenig bekannt ist, und zweitens, weil im Genom der Hefe drei für Phospholipasen B codierende Gene identifiziert werden konnten. Mutanten, denen eines, zwei oder alle drei Phospholipase B - Gene fehlten, sowie Zellen, die nur jeweils eines der Gene überexprimierten, wurden verwendet um die enzymatischen Eigenschaften und Funktionen aller drei Phospholipasen B in vitro und in vivo zu studieren. Ein Vergleich der drei Phospholipasen B zeigte signifikante Unterschiede auf sowohl bezüglich Substratspezifität als auch Funktion in vivo. Phospholipase B1 (Plb1p) ist verantwortlich für den Abbau des quantitativ wichtigsten Phospholipids in Hefe, des Phosphatidylcholins. Plb2p hydrolysiert nur exogene Phospholipide und Lysophospholipide und schützt so (gemeinsam mit Plb1p) Hefezellen vor den toxischen Effekten letzterer und erlaubt die Verwertung von Glycerophospholipiden als Quelle für Fettsäuren und andere brauchbare Komponenten, z.B. Inosit und Cholin. Plb3p hydrolysiert nur Phosphatidylserin und Phosphatidylinositol. Im Gegensatz zu den beiden anderen Phospholipasen B hat Plb3p nur geringe Lysophospholipase Aktivität und ähnelt so eher der cytosolischen Ca-abhängigen Phospholipase A2 höherer Eukaryonten. Aktivität von Phospholipasen kontrolliert die Menge und Zusammensetzung von Phospholipiden in zellulären Membranen sowie die Verteilung von Fettsäuren zwischen Triacylglycerolen (Depotfett) und Phospholipiden. Plb3p reduziert die Sensitivität von Hefezellen gegenüber der toxischen Wirkung von Aluminium-Jonen. Die Aktivität von Phospholipasen B, die in der Plasmamembran lokalisiert sind, ist hoch reguliert und zwar auf der Ebene der Transkription und der Enzymproteine. Letztere Regulation involviert wahrscheinlich bisher nicht eindeutig identifizierte Proteinfaktoren. Hoch regulierend wirken pH des Mediums, zwei- und dreiwertige Kationen, ATP und Fettsäuren, die im Verlauf der Enzym-katalysierten Reaktion freigesetzt werden. Die Phospholipasen B der Hefe sind Serin-Hydrolasen und daher zu Transacylierungsreaktionen befähigt. Dies macht sie zu aussichtsreichen Kandidaten für den Einsatz als Biokatalysatoren zur Herstellung massgeschneiderter Phospholipide. Die heterologe Expression eines Plb1p-GST Fusionsproteins in guter Ausbeute ist gelungen. Somit ist dieses Enzym in ausreichenden Mengen für mögliche Anwendungen zugänglich, z.B. wie erwähnt als Biokatalysator, oder als Zielobjekt für das screening auf effektive Phospholipase B Inhibitoren zur Bekämpfung von Phospholipase B-abhängigen Candida Infektionen.