Strukturbiologie eines Plasmid-Stabilisierungssystems

Bakterielle Plasmide enthalten für die Wirtzelle essentielle Informationen, wie z.B. Resistenzgene, Gene für die bakterielle Infektion und Gene, die für einen Konjugations-apparat kodieren. Um eine gleichmäßige Verteilung der Plasmide auf die Tochterzellen und eine Langzeitstabilität auf viele Generationen hinaus zu ermöglichen, haben sich Stabilisierungssysteme entwickelt. Im Rahmen dieses Projekts haben wir ein Stabilisierungssystem des RP4 Plasmids untersucht. Es besteht aus zwei divergenten Operons, die für insgesamt fünf Proteine kodieren. Das erste Operon enthält eine Resolvase (ParA), das eine Auflösung von Plasmidmultimeren in Monomere bewirkt. Das zweite Operon enthält ein bakterielles Killing-System, das aus einem Toxin-Antitoxin (ParE und ParD) besteht. Dieses Killing-System bewirkt, dass nur plasmidtragende Zellen überleben, während Zellen die dieses Plasmid verloren haben, in ihrem Wachstum stark gehemmt werden, oder durch einen Apoptose-ähnlichen Vorgang zum Absterben gebracht werden. Wir konnten in diesem Projekt die Expressionssysteme für alle fünf Proteine dieses Plasmidstabilisierungssystems in unserem Labor etablieren. Drei dieser Proteine konnten in genügender Reinheit und Menge für biophysikalische Untersuchungen und Kristallisationsversuche dargestellt werden. Die Untersuchungen konzentrierten sich hauptsächlich auf die Resolvase (ParA) und das Antitoxin des Killing-Systems (ParD). Wir konnten zeigen, dass die Resolvase in Lösung als Dimer vorliegt und auch als Dimer an ihre spezifische DNA-Bindungsstelle bindet. Mikrokalorimetrische und biochemische Versuche haben gezeigt, dass die katalytische und die DNA-bindende Funktion in strukturell voneinander unabhängigen Domänen positioniert sind. Das Antitoxin ParD liegt in Lösung als Dimer vor, bindet aber als Tetramer an seine spezifische DNA- Bindungsstelle. Mit CD-spektroskopischen und mikrokalorimetrischen Methoden konnte eine erstaunliche Thermostabilität und eine Reversibilität der thermischen Entfaltung festgestellt werden. Da eine Kristallisation des ParD-Proteins allein oder als DNA-Komplex nicht möglich war, wurde eine Strukturbestimmung mit NMR- spektroskopischen Methoden in Angriff genommen. Mit Hilfe von doppelt markiertem ParD Protein konnten NMR-Experimente durchgeführt werden, die zu einer Aufklärung der Sekundärstruktur des ParD Proteins führten. Ferner wurden alle Experimente durchgeführt, die eine 3D-Strukturberechnung des ParD Proteins ermöglichen. Das ParD-ParE Killing-System hat potentielles wirtschaftliches Interesse durch die mögliche Verwendung als Selektionsmarker. Traditionellerweise werden als Selektionsmarker Resistenzgene verwendet, was aber zur Verbreitung resistenter pathogener Bakterienstämme beiträgt. Diese Idee eines alternativen Selektionssystems wurde bis jetzt mit zwei homologen Killing-Systemen verwirklicht.