BK Kalium Kanäle im Gehirn

K+ Kanäle sind Membranproteine welche selektiv den transmembranären Fluß von K+ Ionen katalysieren. Sie setzen das Ruhemembranpotential und regulieren die elektrische Aktivität von Nervenzellen. Sie bilden aber auch eine "intrinsische Notbremse" welche dem Auftreten pathologischer neuronaler Hyperaktivität entgegen wirkt (z.B. im Rahmen epileptiformer Entladungen). Dieser Forschungsantrag beschäftigt sich nun mit einem wichtigen und weitverbreiteten K+ Kanal im ZNS des Säugers, dem BK Kanal (auch Ca2+-aktivierter K+ Kanal mit hoher Leitfähigkeit genannt). Während die eigentliche ionenselektive Pore (die sogenannte alpha-Untereinheit) bereits kloniert werden konnte ist nur sehr wenig hinsichtlich der Untereinheitenzusammensetzung von neuronalen BK Kanälen, deren funktioneller Beiträge in Bezug auf Erregungsbildung und -ausbreitung oder auch dessen mögliche (direkte) Assoziation mit Ca2+ Kanälen bekannt. In den letzten Jahren wurden neue und selektive Werkzeuge (Toxine und Radioliganden bzw. Antikörper) für diesen Ionenkanal entwickelt. Unter Verwendung dieser Werkzeuge konnte eine (in Abhängigkeit von der untersuchten Hirnregion) prä- aber auch (teilweise) postsynaptische Lokalisation von BK Kanälen gezeigt werden. Dementsprechend befinden sich diese Ionenkanäle in einer strategischen Position für dynamische "Feed-back" Kontrolle des Ca2+ Einstromes und damit einer Modulation der Neurotransmitterfreisetzung. Drei wichtige Fragestellungen sollen im Rahmen dieses Forschungsantrages bearbeitet werden: Aus welchen Untereinheiten setzen sich neuronale BK Kanäle zusammen? Vorläufige Experimente legen den Schluß nahe , daß sich die Untereinheitenzusammensetzung neuronaler BK Kanäle von der des glatten Muskels unterscheidet. Wir planen nun den BK Kanal-Untereinheitkomplex mittels Kombination von klassisch-chromatographischen Techniken, aber auch durch Toxin- und Antikörper- Affinitätschromatographie biochemisch in reiner Form darzustellen. Nach Isolation der Untereinheiten und (teilweiser) Aufklärung der zugrunde liegenden Aminosäuresequenz soll deren CDNA sequenziert werden. Im Abschluß sind funktionelle Untersuchungen geplant um den individuellen Beitrag der Untereinheiten zur Gesamtkanalfunktion aufklären. Wie sind neuronale BK Kanäle auf zellulärer und subzellulärer Ebene verteilt? Die Verteilung von BK Kanälen bzw. derer individueller Untereinheiten soll mittels hochauflösender Rezeptorautoradiopraphie, in in-situ Hybridisierungsexperimenten, in immunhistochemsichen Experimenten bzw. durch Immunolgold-Elektronenmikroskopie untersucht werden. Bilden neuronale BK Kanäle Assoziate mit spannungsabhängigen Ca2+ Kanälen? In den letzen Jahre wurde in einer Vielzahl funktioneller Studien die Assoziatbildung von BK Kanälen mit Ca2+ Kanälen nahegelegt, jedoch ist die Existenz dieser makromolekularen Komplexe auf biochemisch-strukturellem Niveau noch nicht schlüssig gezeigt. Ein weiterer Schwerpunkt dieses Forschungsantrages ist es, diese Assoziatbildung durch Immunpräzipitation in Kombination mit Immunolgold-Elektronenmikroskopie direkt zu beweisen.

Ca2+-aktivierte K+ Kanäle mit hoher Leitfähigkeit (diese Ionenkanalfamilie wird auch BK Kanäle oder maxi-K Kanäle genannt) besitzen wichtige Funktionen im Rahmen der Erregungsbildung und -ausbreitung in Nerven- und Muskelzellen. So stellen diese Kanäle in bestimmten Nervenzellen und in Skelettmuskelzellen einen wichtigen Repolarisationsweg dar. Zusätzlich wurde während der Laufzeit des FWF Projektes P12663-MED auch bekannt daß diese Gruppe von Ionenkanälen an der Regulation des Flüssigkeitstransportes in bestimmten Epithelien (z.B. dem zweischichtigen Epithel des Ziliarkörpers des Auges) mitbeteiligt ist. BK Kanäle sind auf Grund ihrer sehr geringen Dichte erst seit wenigen Jahren biochemischen Arbeitsmethoden zugängig. Diese geringe Dichte ist mitunter durch die sehr hohe Einzelkanalleitfähigkeit bedingt. Diese Klasse von Ionenkanälen wurde 1994 erstmals biochemisch aus dem glatten Muskel der Bronchial- und Aortenmuskulatur gereinigt und ihre Untereinheitenzusammensetzung in diesen Geweben aufgeklärt. Im Rahmen dieses Projektes wurde nun die Untereinheitenzusammensetzung von BK Kanälen im ZNS des Säugers bearbeitet. Wir konnten zeigen daß sich neuronale BK Kanäle signifikant von denen des glatten Muskels unterscheiden. So besitzen neuronale BK Kanäle eine strukturell unterschiedliche Beta-Untereinheit. Deren Beitrag zur Kanalfunktion konnte bisher jedoch nicht etabliert werden. Weiters konnte im Rahmen dieses Forschungsprojektes die Verteilung im ZNS der Ratte unter Zuhilfenahme von gerichteten Antikörpern etabliert werden. Als letzten, aber vielleicht wichtigsten Punkt wurde ihre mögliche Co-Assoziation mit spannungsabhängigen Ca2+ Kanälen bearbeitet. Ca2+ Kanäle können als Bestandteil dieser Ionenkanalassoziate sehr wohl als Quelle für eine cytoplasmatische Ca2+ Erhöhung verantwortlich zeichnen und wären dementsprechend essentiell an der Aktivierung von BK Kanälen mitbeteiligt. Ein Aspekt, der im Rahmen der ursprünglichen Antragstellung unerwähnt blieb, aber zwischenzeitlich wesentliche funktionelle Implikationen bekommen hat, ist die Expression von BK Kanälen im Ziliarkörperepithel des menschlichen Auges. Wie funktionelle Experimente belegen, scheint der Fluß von K+ durch BK Kanäle essentiell an der Kammerwasserproduktion mitbeteiligt zu sein (eine vermehrte Kammerwasserproduktion bzw. ein gestörter Kammerwasserabfluß ist kausal an der Entstehung des Glaukoms beteiligt). So haben im Rahmen dieses Forschungsprojektes durchgeführte funktionelle Experimente an Kaninchen ergeben daß durch topische Applikation eines topisch applizierten BK Kanal Blockers (wir verwendeten Paxillin bzw. Aflatrem) der intraokuläre Druck (IOP) im Mittel um ca. 4mm Hg absinkt. Dieser Reduktion des IOPs ist absolut vergleichbar mit Werten die durch Applikation eines in breiter klinischer Anwendung befindlichen Beta-Sympatholytikums (Timolol) erreicht werden kann. Bemerkenswert ist jedoch die sehr viel höhere Wirksamkeit des BK Kanal Blockers. So stellten sich vergleichbare IOP Reduktion bereits bei einem 1/1000 der verwendeten Substanz ein. (50ng BK Kanal Blocker erzeugen eine IOP Reduktion die mittels Applikation von 50 ug Timolol beobachtet werden konnte).