Genetische Charakterisierung von s-Schicht Glykoproteinen

Das Projekt war im Mai 1998 vom FWF bewilligt worden, wurde am 1. Oktober 1998 begonnen und am 30. September 2001 abgeschlossen. Die Projektziele waren: 1. Genetische Studien zur Charakterisierung der an der Biosynthese des S-Schicht Glykoproteinglykans von Aneurinibacillus thermoaerophilus DSM 10155 involvierten Gene. 2. Die erhobenen Daten sollten durch biochemische Untersuchungen von aktivierten Stoffwechselzwischenprodukten von A. thermoaerophilus ergänzt werden. 3. Elektronenmikroskopische Untersuchungen von Antikörper-markierten Ultradünnschnitten sollten zur Lokalisierung der an der Zuckersynthese von S-Schicht Glykanen beteiligten Enzyme führen. Am Beginn der Genetischen Studien standen die Arbeiten zur Biosynthese von dTDP-L-Rhamnose in Salmonella, die in Zusammenarbeit mit Prof. C. Whitfield, University of Guelph, Kanada, begonnen worden waren. Nachdem der funktionellen Charakterisierung der an dieser Reaktion beteiligten vier Enzyme erfolgten bei Prof. J.H. Naismith, University of St. Andrews, Schottland, Kristallisationsstudien, die zu einem exakten Verständnis der bisher untersuchten enzymatischen Reaktionen führten. Im Zuge der genetischen Experimente zur dTDP-L- Rhamnose Biosynthese im Gram-positiven Bakterium A. thermoaerophilus DSM 10155 war es gelungen, ein DNA-Fragment zu isolieren, auf dem neben den Genen für die Biosynthese der aktivierten Rhamnose auch die von aktivierter Heptose lokalisiert waren. Bisher war Heptose nur als Zuckerbaustein von Gram-negativen Bakterien bekannt gewesen. Um Nachbarregionen von bereits bekannten DNA-Abschnitten rascher analysieren zu können, wurde eine einfache Methode des "Chromosome walkings" entwickelt. Im Rahmen der biochemischen Untersuchungen erfolgte die Strukturanalyse der core-Oligosaccharide des S- Schicht Glykoproteins von A. thermoaerophilus DSM 10155. Dabei wurde zum erstenmal die Heterogenität von core-Oligosacchariden im Detail untersucht und das Vorkommen von neuen glykosidischen Bindung bei diesen bakteriellen Glykoproteinen beschrieben. Vergleichende Untersuchungen mit anderen S-Schicht Glykoproteinen führten zu einem besseren Verständnis des allgemeinen Aufbaus dieser Glykokonjugate. Neben der Strukturanalyse der Glykane von A. thermoaerophilus DSM 10155 wurde erstmals auch ihre Biosynthese teilweise charakterisiert. Gegenwärtig werden in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. J. Peter-Katalinic, Universität Münster, weiterführende massenspektrometrische Untersuchungen durchgeführt. Die elektronenmikroskopischen Untersuchungen des Stoffwechselwegs von nukleotid-aktivierter L-Rhamnose in A. thermoaerophilus DSM 10155 bestätigten die Ergebnisse der genetischen und biochemischen Untersuchungen. Zusammenfassung Im Projekt P12966-MOB erfolgte erstmals erfolgreich eine schrittweise molekularbiologische Teilcharakterisierung der S-Schicht Glykoproteinglykan-Biosynthese von Gram-positiven Bakterien. Die Untersuchungsergebnisse weisen zum Teil auf völlig neue Synthesewege. Durch die Strukturaufklärung der Zuckerketten wurde einerseits bereits bekanntes Wissen bestätigt, andererseits wurden wesentliche neue Erkenntnissen über den allgemeinen Aufbau von bakteriellen Glykoproteinen erarbeitet. Die Ergebnisse aus diesem Projekt stellen die Basis für zukunftsorientierte Anwendungen von S-Schicht Glykoproteinen in Biotechnologie, Biomedizin und Nanotechnologie dar. So könnte z.B. die deutlich höhere thermische Stabilität der Glykosylierungsenzyme des thermophilen Organismus Aneurinibacillus thermoaerophilus im Vergleich zu den selben Enzymen aus dem mesophilen Stamm Salmonella enterica zu interessanten biotechnologischen Anwendungen dieser Enzyme, wie z.B. zum Einsatz auf einem "Glyco-Chip" für das high-throughput Screening führen.