Xlrbpa-PKR Interaktion

Das doppelstrang-RNA bindende Protein Xlrbpa wird intrazellulär mit hnRNAs und Ribosomen assoziiert gefunden. An hnRNAs wird das Protein vor allem in Form von hnRNP Partikeln gefunden, während der Mechanismus der ribosomalen Assoziation von Xlrbpa noch unklar ist. Es ist jedoch anzunehmen, daß Xlrbpa direkt an ribosomale RNAs binden kann und so mit Ribosomen assoziiert. Homologe Proteine von Xlrbpa wurden bisher in Maus und Mensch gefunden wo diese durch deren Bindung an Protamin-RNA bzw. HIV-TAR RNA isoliert wurden. Die generellen RNA Bindungseigenschaften von Xlrbpa und dessen Homologen, sowie in vitro und in vivo Bindungsstudien lassen jedoch vermuten, daß diese RNA Bindungen nicht spezifisch sind, sondern lediglich die extensive sekundärstruktur dieser beiden RNAs widerspiegelt. Da Xlrbpa über drei RNA-Bindungsdomänen verfügt, sonst jedoch keine weiteren strukturelle oder katalytische Domänen aufweist, läßt sich dessen zelluläre Funktion nur schwer abschätzen. Neuere Daten zeigen jedoch, daß TRBP, das menschliche homologe Protein zu Xlrbpa, mit der doppelstrang-RNA aktivierten Kinase PKR interagieren und diese auch regulieren kann. PKR ist ein an der zellulären antiviralen Verteidigung beteiligtes Enzym, welches durch Interferon transkriptionell stimuliert wird. Doppelsträngige RNAs, welche während einer viralen Infektion -bedingt durch die virale Replikation-, vermehrt auftreten, aktivieren die Kinase über deren doppelstrang-RNA bindende Domänen. Die aktivierte Kinase phosphoryliert den Translations-Initiationsfaktor eIF2a, was in weiterer Folge zu einer Inhibierung der Translation und somit der viralen Replikation führt. Es konnte kürzlich gezeigt werden, daß TRBP die Aktivierung der PKR Kinase verhindern kann. Jedoch ist es nicht klar, ob eine Interaktion zwischen TRBP und PKR über direkte Protein-Protein Wechselwirkung oder über eine RNA-Brücke erfolgt, da die vorliegenden Daten beide Möglichkeiten einschließen. Ziel dieses Projektes ist es daher, die Interaktion zwischen Xlrbpa und PKR zu studieren. Dies soll zum einen im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae erfolgen, da hier die Manipulation der Proteine und einzelner Parameter sehr einfach vorgenommen werden kann. In weiterer Folge soll jedoch das Xenopus Homologe der PKR Kinase isoliert werden, um so die Interaktion von PKR und Xlrbpa auch unter natürlichen Bedingungen untersuchen zu können. Ein wesentlicher Bestandteil der vorgeschlagenen Untersuchungen wird sich dabei mit der Analyse der Art der Interaktion der beiden Proteine beschäftigen. Um diese Frage genauer beantworten zu können, sollen vor allem Mutationen in beiden Protein hergestellt werden und deren Einfluß auf die Interaktion der beiden Komponenten getestet werden.

Funktion und Schicksal der meisten zellulären RNAs ist massgeblich durch RNA-bindende Proteine, welche mit diesen interagieren, beeinflusst. Es ist daher verständlich, dass RNA-bindende Proteine viele zelluläre Prozesse maßgeblich beeinflussen. Die spezifische Erkennung von RNAs durch die and diese bindenden Proteine ist daher von grosser Wichtigkeit. In der Regel erfolgt RNA-Erkennung durch bestimmte konsrvierte Proteinmotive, welche entweder sequenz- oder aber auch strukturspezifisch mit RNAs in Wechselwirkung treten. Proteine mit doppelstrang-RNA Bindungsmotiven (dsRBDs) erkennen strukturierte doppelsträngige RNA, sind jedoch nicht zur sequenzspezifischen RNA-Erkennung befähigt. Die durch Interferon stimulierte Kinase PKR besitzt 2 dsRBD Motive und wird über diese durch doppelsträngige, virale RNAs aktiviert. Aktivierung von PKR inhibiert die Proteinsynthese und somit virale Replikation. Interessanterweise führen nur virale, nicht jedoch zelluläre RNAs zur Aktivierung von PKR. In diesem Projekt konnten wir zeigen, dass die unbeabsichtigte Aktivierung von PKR durch zelleigene dsRBD- Proteine verhindert werden kann. Unsere Untersuchungen konnten zeigen, dass direkte Konkurrenz um RNA Bindung die Aktivierung von PKR verhindert. Das Xenopus Protein Xlrbpa und dessen verwandte Säugerproteine scheinen wesentliche Antagonisten von PKR in dem oben beschriebenen Mechanismus darzustellen. Xlrbpa besitzt 3 dsRBD Domänen, von denen jedoch nur 2 aktiv RNA binden können. Unsere Untersuchungen zeigten, dass die dritte dsRBD in Xlrbpa für Dimerisierung und somit direkte Protein-Protein Interaktion verantwortlich ist. Dies stellt eine neue, bisher nicht bekannte Funktion für dieses RNA-Bindungsmotiv dar.