Wechselwirkung zwischen Chemokinen und Heparan Sulfat

Die Wechselwirkung von Chemokinen mit Glykosaminoglykanen (GAG) wie Heparansulfat ist vermutlich verantwortlich für die gewebsspezifische Rekrutierung von Leukozyten am Ort einer Entzündung. Dort ist es Aufgabe der GAG, die Chemokine ihren Zielzellen zu präsentieren, indem sie die Chemokine multimerisieren und dadurch deren lokale Konzentration erheblich erhöhen. Wir wollen in diesem Projekt die Biophysik der Chemokin/GAG Interaktion am Prototyp Interleukin-8 (IL-8) untersuchen, das in unserem Labor rekombinant exprimiert und gereinigt wird. Zu diesem Zweck werden wir zu Beginn HS(-ähnliche) Oligosaccharide mit gleicher Länge und gleichem chemischen Modifizierungsmuster (Sulfonierung/Acetylierung) herstellen. Obwohl vor kurzem eine IL-8-spezifische HS-Domäne identifiziert wurde, wollen wir das Bindungsverhalten von IL-8 an unterschiedlich lange und unterschiedlich chemisch modifizierte HS-Oligosaccharide untersuchen, da in vivo die Polymerisation von Chemokinen an GAG differentielle Bindungsstellen am Polysaccharid erfordert. Zur biophysikalischen Charakterisierung der Wechselwirkung werden wir Fluoreszenz- und CD-Spektroskopie, Isothermische Titrationskalorimetrie, sowie Stopped-Flow Kinetik heranziehen. Die geplante Aufklärung der 3-D Struktur eines spezifischen IL-8/HS Oligosaccharid Komplexes wird es uns erlauben, detailliertere Aussagen über den Mechanismus der Interaktion zu treffen sowie langfristig chemische Strategien zur Interferenz zu entwickeln. Um ein allgemeineres Bild der Chemokin/GAG Wechselwirkung zu erhalten wollen wir unsere Studien auf ein weiteres Mitgleid der C-X-C Familie, GRO-alpha/MGSA, sowie auf zwei weitere Mitglieder der C-C Chemokin- Familie, MCP-1 und RANTES, ausdehnen. Durch Anwendung derselben Methoden und durch Einsatz identischer HS-Oligosaccharide wie im Falle von IL-8 hoffen wir, ein vergleichendes und damit verläßlicheres biophysikalisch-strukturelles Modell der Chemokin/GAG Interaktionen zu erhalten. Zusätzlich zu den molekularen biophysikalischen Studien planen wir, abhängig vom Projektfortschritt, zelluläre Bindungsstudien. Zu diesem Zweck soll HS an Zelloberflächen fluoreszenzmarkiert und die Änderung der Fluoreszenzintensität bei Chemokin- Zugabe quantifiziert werden. Damit können wir molekulare und zelluläre Bindungsaffinitäten vergleichen und gleichzeitig kann dieses System als Bio-Assay zum Screening anti-inflammatorischer Verbindungen verwendet werden.