HPV-16 E7 als Regulator der Transkription

In dem vorliegenden Antrag soll untersucht werden, welche Rolle das E7-Protein des menschlichen Papillomvirus HPV-16 bei der Regulation der zellulären Genexpression spielt. Dabei sollen insbesondere neue Mechanismen der E7-abhängigen Genregulation untersucht werden. So soll geprüft werden, ob die Fähigkeit von E7 zur Veränderung der zellulären Genexpression auf einer funktionellen und/oder physischen Interaktion mit Chromatin- modifizierenden Enzymen beruht, seien es Histonacetyltransferasen oder Histondeacetylasen. Derartige Wechselwirkungen sollen mittels biochemischer Methoden nachgewiesen und anschließend in Genexpressionsstudien funktionell analysiert werden. In diesem Zusammenhang wird die Frage gestellt, ob die Fähigkeit des E7-Proteins, die Transkription der Gene für Cyclin E und Cyclin A zu stimulieren, auf einer Wechselwirkung mit Chromatin-modifizierenden Enzymen beruht. Weiters soll die Frage untersucht werden, ob E7 neben seiner Eigenschaft als Aktivator der Transkription auch die Repression bestimmter Gene bewirken kann. Hierbei soll zunächst eine Gruppe von Genen untersucht werden, deren Expression im Zuge der Zelltransformation reprimiert wird. Dabei soll die Frage geklärt werden, ob E7, in funktioneller Analogie zu dem Myc-Onkoprotein, die Expression von Myc-regulierten Genen negativ beeinflussen kann. Des weiteren soll untersucht werden, ob E7, wie bereits für Myc gezeigt, die Aktivität des Differenzierungs-abhängigen Transkriptionsfaktors C/EBP spezifisch blockieren kann. Die beschriebenen Untersuchungen sollten zu einer genaueren Definition der Mechanismen beitragen, mit denen das E7-Onkoprotein zelluläre Genexpression beeinflussen kann.

Ziel dieses Projektes war es, zu untersuchen, in welcher Weise das E7-Onkoprotein von menschlichen Papillomviren zur Tumorentstehung beiträgt. Hierbei wurde besonderes Augenmerk gelegt auf die E7-abhängige Aktivierung von bestimmten Zellzyklusgenen, insbesondere des Genes für Zyklin E, welches einen der wichtigsten zellulären Schalter darstellt, die betätigt werden müssen, um den Eintritt der Zelle in die Wachstumsphase zu erleichtern. Die Experimente ergaben, dass durch Inhibitoren der Histondeacetylaseaktivität die E7-abhängige Aktivierung des Zyklin E-Gens blockiert werden kann. Hierbei spielen offenbar Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren E2F und SP1 eine wichtige Rolle. Weiterhin konnten wir zeigen, dass zelluläre Histondeacetylasen auch im Zusammenhang mit Mechanismen der Tumorsuppression, die als "zelluläre Seneszenz" bezeichnet wird, reguliert werden. Mit dem Erreichen der zellulären Seneszenz treten Veränderungen in Histondeacetylasekomplexen auf. So konnten wir zeigen, dass eine bestimmte Histondeacetylase, als HDAC2 bezeichnet, in jungen Zellen in anderen Multiproteinkomplexen vorkommt als in alten Zellen. Diese Resultate lassen den Schluss zu, dass zelluläre Seneszenz u.a. durch Repressorkomplexe, welche HDAC2 enthalten, vermittelt wird. In weiteren Experimenten wurden weitere Mechanismen analysiert, mit denen E7 die zelluläre Seneszenz durchbrechen kann. Bei diesen Untersuchungen ergab sich, dass E7 direkt mit verschiedenen Enzymen der Glykolyse interagiert und die Aktivität dieser Enzyme verändert. Wir konnten zeigen, dass in seneszenten Zellen die Pyruvatkinase, ein Schlüsselenzym der Glykolyse, in einer besonderen Konformation vorliegt, welche sich durch sehr hohe Substrataffinität auszeichnet. Unter diesen Umständen ist eine Verwendung von Glukose als Vorläufer für Nukleotidbiosynthese nicht mehr möglich, da der größte Teil der eingesetzten Glukose zur Energieproduktion verwendet wird. Diese Veränderung des Metabolismus führt zum Wachstumsarrest, der mit der Seneszenz bekanntlich verbunden ist. Wir konnten zeigen, dass die Brechung der Seneszenz, durch das E7- Onkogen von HPV-16, zu einer Wiederaufnahme der Zellproliferation führt. Dabei wurde auch gezeigt, dass dies unter anderem darauf beruht, dass durch E7 die Pyruvatkinase wieder in die (dimerische) Ausgangskonformation zurück überführt wird. In weiteren Experimenten konnten wir zeigen, dass E7 auch an die saure Glukosidase bindet und durch allosterische Regulation zu einer Erhöhung der Enzymaktivität führt, wodurch weitere Glukose aus zellulärem Glykogen bereitgestellt wird. In einem aus diesen Befunden abgeleiteten Modell ergibt sich, dass die transformierende Wirkung des E7-Onkogens neben Transkriptionseffekten auch auf distinkten Veränderungen des Zuckerstoffwechsels beruht.