Ausbildung Quartärstruktur tetramerer Häm-haltiger Katalasen

Typische Katalasen sind tetramere, hämhaltige Enzyme mit außerordentlich hoher katalytischer Effizienz, wofür die intakte Quartärstruktur eine notwendige Voraussetzung darstellt. Diese weist eine Pseudo-Verknotung zwischen benachbarten Monomeren auf, die durch sog. Armaustausch (domain swapping) zustande kommt. Dabei hakt sich der N-terminale Arm einer Untereinheit in eine enge Öse ein, die von der sog. wrapping-Domäne der benachbarten Untereinheit gebildet wird. Ein tatsächliches Einfädeln des Arms in die bereits vorgeformte Öse scheint nahezu unvorstellbar. Wir schlagen deshalb ein alternatives Modell für die Assemblierung typischer Katalasen vor. Dabei assoziieren zwei unvollständig gefaltete Monomere, die späteren Knoten würden durch Andocken der zunächst von diesem primären Addukt wegragenden Abschnitte in geordneter Reihenfolge entstehen. Um diesen Mechanismus grundsätzlich zu belegen, und um zwischen vier möglichen Varianten zu unterscheiden, sollen diese primären Zwischenprodukte durch kovalente Verbindung der daran beteiligten Abschnitte der Untereinheiten abgefangen werden. Dazu werden zunächst Cysteinreste in das Molekül eingebaut, die die Ausbildung von Disulfidbrücken in den verschiedenen Kontaktregionen zwischen den Untereinheiten ermöglichen sollen. Die Experimente werden mit Katalase A durchgeführt, deren Kristallstruktur bekannt ist. Der gewünschte Erfolg dieser Modifikation wird voraussichtlich ein nachträgliches Adaptieren durch gerichtete Evolution erfordern, was mittels DNA shuffling erreicht werden kann. Anschließend werden in allen so erhaltenen Disulfid-verknüpfbaren Subvarianten weitere Modifikationen eingeführt, die die mutmaßlich anschließenden Schritte des assembly-Prozesses unmöglich machen sollen (das betrifft im Wesentlichen die unmittelbar in die Verknotung involvierten Proteinabschnitte). Die in vivo- Assemblierung sollte dann an dieser Stelle zum Stillstand kommen, Isolierung der durch bereits erfolgte kovalente Verknüpfung stabilisierten Zwischenprodukte erlaubt deren Identifizierung. Ein Nebenprodukt dieses Projekts wird die Herstellung kovalent verknüpfter, also deutlich stabilisierter Katalase sein. Unter Umständen gelingt die Isolierung ausreichend stabiler dimerer Katalase um deren katalytische Eigenschaften zu charakterisieren. Ein wichtiges Teilprojekt sieht den Versuch der Herstellung monomerer Katalase vor. Nach Beseitigung einiger die Beweglichkeit limitierender Prolinreste, und Einführung eines ausreichend langen Extra-loops zwischen N- terminalem Arm und dem zentralen globulären Teil des Proteins sollte eine Variante entstehen, bei der der Pseudoknoten aus Abschnitten desselben Polypeptids gebildet werden kann, die also keinen Armaustausch mehr zuläßt. Ein derartiges Produkt wäre nicht nur äußerst interessant im Hinblick auf potentielle biotechnologische Anwendungen, sondern könnte auch den Zusammenhang zwischen Quartärstruktur und Funktion in typischen Katalasen aufklären.

Es ist durch Einführung von Cysteinresten mittels gerichteter Mutagenese gelungen, in 3 verschiedenen Kontaktregionen kovalente Disulfidbindungen zwischen Paaren von Untereinheiten im tetrameren Enzym Katalase A aus Bäckerhefe einzuführen. Nach Einführen weiterer Veränderungen wurde damit begonnen, den Ablauf jener Vorgänge zu untersuchen, die zu einer Verknotung einzelner Abschnitte dieser Untereinheiten miteinander führen. Typische Katalasen sind aus 4 identischen Untereinheiten aufgebaute Enzyme, deren Einzelketten in einer sehr komplexen Struktur ineinander verwoben sind ("Pseudoknoten"). Es wurde ein Modell zur möglichen Ausbildung dieser Struktur im Zuge der Neusynthese eines typischen Vertreters, der Katalase A aus Bäckerhefe aufgestellt. Das Modell sollte durch "Einfrieren" der in den einzelnen Phasen dieses Vorganges vorliegenden Kontakten verifiziert werden. Zu diesem Zweck wurden an verschiedenen potenziellen Kontaktzonen durch gezielte Mutagenese Cysteinreste eingeführt, die bei entsprechender Nähe eines analogen Partners kovalente, stabile Disulfidbindungen eingehen können. Die dafür zunächst erforderlichen Cysteinreste wurden in 4 verschiedenen Regionen des Proteins eingeführt. Die mit der Einführung von Mutationen unvermeidlicherweise einhergehende Veränderung der Proteineigenschaften war in einer dieser Regionen durchwegs zu weitgehend, in den anderen 3 Regionen ergab sich zumindest jeweils ein Paar miteinander reaktionsfähiger Cysteine. Leider erwies sich die Rate der (oxidativen) Ausbildung der Disulfidbindungen unter authentischen Bedingungen der Proteinherstellung als zu niedrig, sie konnte auch durch erhöhten oxidativen Stress oder Ausweichen auf einen anderen Organismus (Pichia pastoris) nicht wesentlich verbessert werden. Letztlich blieb nur das Einschleusen des Enzyms auf den sekretorischen Weg von Erfolg gekrönt, wobei durch Fusion mit dem entsprechenden Signalpeptid das Protein über das, der Ausbildung von Disulfidbrücken sehr förderliche endoplasmatische Retikulum letztlich in das überstehende Medium abgegeben wird. Diese in diesem Umfang nicht erwarteten Schwierigkeiten haben dazu geführt, dass erst gegen Ende der Laufzeit mit der Aufklärung der Chronologie der Ereignisse beim Zusammenbau des Enzyms begonnen werden konnte, wozu bisher nur vorläufige Ergebnisse vorliegen. Die weitergehende Bedeutung dieses Projekts liegt darin, dass (vermutlich erstmalig) stabile kovalente Bindungen zwischen den einzelnen Untereinheiten eines löslichen Proteins gebildet werden konnten, die neben ihrer Bedeutung als Voraussetzung für die Aufklärung der Bildung des Pseudoknotens auch zu einer fundametalen Erhöhung der Stabilität des Enzyms führen (Katalasen tendieren in verdünnter Lösung zum irreversiblen Dissoziieren in die isolierten Untereinheiten; nachdem das mit dem völligen Verlust der katalytischen Aktivität begleitet ist, hat das bislang den technologischen Einsatz von Katalasen extrem behindert). Eine der hergestellten Proteinmutanten zeigte unerwartete Eigenschaften: Die Mutante L47C tendiert zur spontanen teilweisen Umfaltung, das resultierende (stabile) Produkt zeigt starke Ähnlichkeit mit Vertretern der pharmakologisch äußerst interessanten Cytochrom P450-Familie, ohne allerdings deren Komplexität und hohe Instabilität zu zeigen. L47C könnte als Modell für diese Enzymklasse ausgebaut werden.