Die Bedeutung von Metallionen in rRNA

In der Zelle ist das Ribosom die zentrale Schaltstelle für die Produktion von Proteinen und auch deshalb ein Hauptangriffspunkt für viele Antibiotika. Am Ribosom wird die genetische Information der mRNA in die Aminosäuresequenz der Proteine umgeschrieben. Die Verknüpfung der Aminosäuren (Peptidsynthese) wird durch eine am Ribosom lokalisierten Aktivität (Peptidyltransferase) katalysiert. In der letzten Zeit sind viele Ergebnisse publiziert worden, die darauf hinweisen, dass diese Enymaktivität von der rRNA katalysiert sein könnte. Wir haben daher ein Modell entwickelt, das vorschlägt, dass die Katalyse der Peptidsynthese durch Metallionen, die an RNA gebunden sind, stattfindet. Dafür spricht, dass bekannt ist, dass die Struktur und Funktionen dieses evolutionär sehr konservierten Enzymkomplexes stark von der Magnesiumkonzentration abhängt. Es ist aber über die Bindungsstellen dieser Metallionen am Ribosom sehr wenig bekannt. Das Ziel dieses Projektes ist es nun, einerseits die Metallionenbindungsstellen der rRNA genauer zu charakterisieren, anderseits zu untersuchen, ob Metallionen an der Katalyse der Peptidsynthese beteiligt sind. Die Methodik der spezifischen Metallhydrolyse von RNA mit verschiedenen Metallen soll uns einerseits helfen, die Änderungen in der Feinstruktur der rRNA und tRNA während des Ribosomenzyklus zu überprüfen, anderseits soll sie dazu dienen, spezifische Metallbindungsstellen am Ribosom genauer zu charakterisieren. Um unser Modell der metallkatalysierten Peptidsynthese zu falsifizieren, sollen Thiosubstituierte P-Stellensubstrate synthetisiert werden. Die Kinetiken dieser modifizierten Substrate und sogenannte "metal ion rescue" Experimente mit anderen Metallen sollten Aufschluß darüber geben, ob Metallionen die Peptidsynthese katalysieren und dadurch einen wichtigen Beitrag zu dem viel diskutierten Problem liefern, ob RNA oder Proteine die Peptidsynthese katalysieren.

Das Ribosom, ein komplexes Partikel, das aus RNA und Proteinen besteht, ist die zentrale Schaltstelle für die Produktion der Proteine in einer Zelle. Hier wird die genetische Information der Boten RNA (mRNA) in die Aminosäuresequenz der Proteine umgeschrieben. Bei diesem Schritt müssen zwei mit Aminosäuren beladenen tRNAs korrekt an die mRNA am Ribosom gebunden werden, wobei die Verknüpfung der Aminosäuren (Peptidsynthese) durch eine am Ribosom lokalisierte Aktivität (Peptidyltransferase) katalysiert wird. Bei der Translokation wird der tRNA/mRNA Komplex um ein Triplettkodon weitergeschoben, sodass die nächste Aminosäure in die wachsende Peptidkette eingebaut werden kann. Diese dynamischen Schritte werden durch GTP beschleunigt, aber was sich bei dieser Translationsmaschine tatsächlich bewegt, war unbekannt. Die strukturelle Integrität des Ribosoms und faktisch alle Funktionen sind absolut von Magnesiumionen abhängig. Dieses Projekt hat nun die Bedeutung der Metallionen für die Peptidsynthese untersucht und hat auch die sensitive Methode der Metallinduzierten RNA Spaltung dazu benutzt, um Strukturänderungen in der RNA während der Translokation zu untersuchen. Tatsächlich haben wir in der 23S RNA in der Nähe des Peptidyltransferasezentrums translationsabhängige Strukturänderungen feststellen können. Diese Strukturänderungen traten bei jedem neuen Translokationsschritt wieder auf. Zusätzlich ist es uns gelungen, pH abhängige Strukturänderungen im Peptidyltransferasezentrum nachzuweisen, was sehr gut mit der pH Stimulierung der Peptidsynthese korrelierbar ist. Zusätzlich wurden auch Versuche durchgeführt, die über den Mechanismus der chemischen Katalyse der Proteinsynthese Aufschluss geben sollten. Mit Hilfe von chemisch modifizierten Substraten haben wir zeigen können, dass die benachbarte Hydroxylgruppe des Aminoaclyesters eine enorme Bedeutung für die Geschwindigkeit der Peptidsynthese hat, die möglichweise durch ein Metallion gesteuert wird. Diese Untersuchungen könnten interessante Hinweise zur Funktion des Ribosoms und auch Aufschlüsse über die Wirkungsweise von Antibiotika geben.