Picornavirale Leader Proteinasen

Maul-und-Klauen Seuche Virus (MKSV) bleibt ein wirtschaftlich wichtiges Tierpathogen. Seine Replikation hängt ganz von der Aktivität von drei vom Virus selbst kodierten Proteinasen ab. Eine dieser Proteinasen ist das Leader Peptid (jetzt als Leader Proteinase (L pro ) bezeichnet); diese Proteinase spaltet das virale Polyprotein (das erste Produkt der viralen Proteinsynthese) an einer Stelle und erkennt ferner ein zelluläres Substrat, den "eukaryotic initiation factor" (eIF) 4G. Die Zelle kann ihre "gecappte" mRNA danach nicht mehr translatieren; die virale mRNA bliebt verschont, da die Translation hier nicht über eine Cap-struktur, sondern intern initiziert wird. Ziel dieses Projektes ist es, die MKSV Lbpro nicht nur strukturell und biochemisch, sondern auch zellbiologisch zu charakterisieren indem weitere zelluläre Substrate für dieses Enzym identifiziert werden. Darüber hinaus soll die Wirkung dieser Spaltung auf die Physiologie der Wirtszelle während einer MKSV-Infektion überprüft werden. Die wichtigste Errungenschaft des Vorprojekts (P-11222-MED) war die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur der Lbpro Form der MKSV Leader Proteinase (Guarne et al, (1998) Embo J. 7469-7479). Die Struktur zeigt, dass das Protein im allgemeinen wie Papain gefaltet ist und deutet an wie beim Selbst-Prozessieren der wachsenden Peptidkette das Enzym den eigenen C-Terminus erkennt. Trotz dieser wichtigen Erkenntnisse müssen drei grundlegende Fragen über die Lbpro beantwortet werden. 1/ Was ist der genaue enzymatische Mechanismus der Lbpro ? 2/ Die drei-dimensionale Struktur deutet darauf hin, dass die Erkennung der Lbpro Spaltstelle in eIF4G über einen basichen Rest (C-terminal von der hydrolysierten Bindung) stattfindet. Das Enzym kann daher Kontakte mit Aminosäureresten herstellen, die entweder N-terminal oder C-terminal zur Spaltstelle liegen. Welche Aminosäuren in einem Substrat werden von der Lbpro tatsächlich erkannt? 3/ Die Fähigkeit der Lbpro , Substrate auf verschiedene Weisen zu erkennen, ist ein wichtiger Hinweis darauf, dass sie zusätzlich zu eIF4G noch eine Reihe weiteren Substrate besitzt. Welche weitere Proteine werden erkannt? Hat die Lbpro Funktionen, die über das Selbst- Prozessieren des Polyproteins und die Inhibierung der Translation gecappter mRNA hinausreichen? Das Projekt wird diese Fragen bearbeiten. Der enzymatische Mechanismus wird durch die Einführung spezifischer Mutationen in die Lbpro untersucht werden. Weiters werden fluoresierende Oligopeptide, die von den Sequenzen der zwei bekannten Spaltstellen abgeleitet sind, eingesetzt, um die enzymatischen Parameter zu bestimmen. Dadurch werden auch jene Aminosäuren identifiziert, die für die Substraterkennung wichtig sind. Die Substratspezifität wird mit Hilfe der mutierte Spaltstelle in eIF4G als auch durch die Verwendung von substituierten Oligopeptiden untersucht werden. Weiters soll die Struktur einer inaktiven Lbpro Mutante im Komplex mit einem Oligopeptid aufgeklärt werden. Schliesslich werden drei Methoden eingesetzt werden, um weitere zelluläre Substrate der Lbpro zu identifizieren. i/ Detektierung von Proteinen in Säugetierenextrakten, die von der Lbpro gespalten werden können, durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese ii/ Aufbau eines Hefe "Two- Hybrid" Systems mit einer inaktiven Lbpro Mutante iii/ Exprimierung der aktive Wildtypproteinase unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoters in Hefe. Proteine, die durch diese Ansätze als Substrate für die Lbpro identifiziert werden, werden danach untersucht, ob sie bei einer MKSV-Infektion gespalten werden und wie die Physiologie der Wirtszelle dadurch beeinflusst wird.

Das Maul- und Klauenseuche Virus (MKSV) ist und bleibt ein ökonomisch wichtiges Tierpathogen aus der Familie der Picornaviren. Seine Replikation ist von der Aktivität dreier viraler Proteinasen abhängig. Eine dieser Proteinasen ist die Leader Proteinase (L pro ). Sie ist eine papain-ähnliche Cysteinproteinase, die einmal am viralen Polyprotein, dem primären Produkt viraler Proteinsynthese, spaltet und weiters zumindest ein zelluläres Protein, den eukaryontischen Initiationsfaktor (eIF) 4G, prozessiert. Dadurch wird die Initiation der Proteinsynthese gecappter mRNA verhindert. Die Synthese von Proteinen viraler mRNA bleibt hingegen unbeeinflusst, da sie keine cap- Struktur benötigt. Eine ähnliche Spaltreaktion findet auch bei anderen Vertretern der Picornavirusfamilie, wie z. B. dem humanen Rhinovirus (HRV) oder Poliovirus, statt. Hier führt jedoch eine chymotrypsin-ähnliche Proteinase (2Apro ) die eIF4G-Spaltung durch. In diesem Projekt setzten wir biochemische und strukturbiologische Ansätze ein, um die Interaktion der Lpro von MKSV bzw. der 2A pro von HRV mit eIF4G zu charakterisieren. Das Untersuchen und Verstehen dieser Reaktion ist sehr wichtig, da sie einen wichtigen Parameter der Virulenz in MKSV und Swine Vesikular Disease (einem wichtigen Picornavirus beim Schwein) darstellt. Zusätzlich sollen proteinchemische und zellbiologische Experimente entwickelt werden, um nach weiteren zellulären Substraten von Lpro zu suchen und ihre Beziehung zu Vorgängen in der Wirtszelle während der Replikation von MKSV festzustellen. 4 grundlegende Durchbrüche konnten in diesem Projekt erzielt werden. Erstens wurde die dreidimensionale Struktur der Lpro auf 1.9 Å bestimmt. Zweitens wurde ein effizientes System mit Hilfe von Retikulozytenlysat entwickelt, mit dem es möglich ist, die eIF4G-Spaltung mit Konzentrationen der Lpro bzw. 2Apro Proteinasen durchzuführen, die denen bei einer Infektion in vivo ähnlich sind. Dieses System wurde in weiterer Folge dazu verwendet, um zu zeigen, dass die aus 18 Aminosäuren bestehenden C-terminale Extension (CTE) der Lpro , obwohl sie sich nicht in der Nähe des aktiven Zentrums befindet, nötig ist, um eIF4G zu spalten. Schliesslich konnte noch eine direkte Interaktion der Lpro und 2Apro mit einer Region auf eIF4G in der Nähe der Spaltstelle nachgewiesen werden, die im Falle von Lpro auch die CTE involvierte. Diese Ergebnisse helfen uns, die Mechanismen zu verstehen, die diese zwei unterschiedlichen Proteinasen entwickelt haben, um Moleküle der Wirtszelle zu ändern. Solche Befunde bilden ein Teil des grösseren Rätsels, wie diese Viren, die für höchstens 14 reife Proteine kodieren, eine viel komplexere Säugetierzelle verändern können, so dass sie nach nur wenigen Stunden in eine Virus produzierende Fabrik umgeschaltet wird.