Harn-PCR als Routinediagnostik der Lyme Borreliose

Forschungsprojekt P 13688Harn-PCR als Routinediagnostik der Lyme BorrelioseElisabeth ABERER, Bruno SCHMIDT28.06.1999 Die serologische Labordiagnostik der Lyme Borrehose (LB), einer Multisystemerkrankung mit beträchtlicher Morbidität ist bis jetzt unzulänglich, da sie eine aktuelle Infektion höchstens bestätigen kann, für die Beurteilung eines Therapieerfolges jedoch völlig ungeeignet ist. Der Nachweis von Borrefia burgdorferi-DNA im Harn ist eine innovative Untersuchungstechnik, die weltweit, allerdings nicht routinemäßig, und an einem heterogenen Krankengut durchgeführt wird. Ihre Wertigkeit ist noch umstritten, da Unterschiede in der Auswahl der zu amplifizierenden Oligonucleotidsequenzen aus Chromosomen oder Plasmiden sowie Unterschiede in Extraktionsmethoden widersprüchliche Ergebnisse dieser Untersuchungen ergeben. Eigene Voruntersuchungen mit Flagellin-Primer haben ergeben, daß während einer akuten Borrelieninfektion Borrelien-DNA ab dern 4. Tag nach Infektion bis etwa 5-8 Monate danach, abhängig davon, ob es sich um ein isoliertes Erythema migrans (EM) oder ein EM mit Allgemeinsymptomatik handelt, ausgeschieden wird. Ziel unseres Projektes ist es, diese Untersuchungen unter Verwendung weiterer Primer und Präparationsmethoden zu validieren, die Methodik zu verbessern, Probleme durch Kontamination zu vermeiden, und zu prüfen, ob sie überhaupt als verläßliche in vitro-Diagnostik der LB eingesetzt werden kann. Es ist geplant, zunächst mit 4 Primer an Patienten mit EM Voruntersuchungen durchzuführen, um dann mit den 2 als besten eingestuften Primer weiterzuarbeiten. Der Aussagewert dieser Untersuchungen soll überprüft werden an 20 Patienten mit EM und 15 Patienten mit Acrodermatitis chronica atrophicans, die sowohl vor und nach Therapie, sowie nach 3, 6 und 12 Monaten untersucht werden. Eine Korrelation zu Ergebnissen aus Kultur von Hautbiopsien soll hergestellt werden. Weitere Untersuchungen sollen an 150 Patienten mit verschiedenen dermatologischen Diagnosen, 50 Patienten mit Arthritis oder Arthralgien oder Neuroborreliose, und, zur Kontrolle, an 50 Blutspendern durchgeführt werden. Gleichzeitig sollen parallel bei allen untersuchten Patienten Borrelien-Antikörper mit kommerziellen ELISA-Methoden untersucht werden. Sollte sich der Test für die Routinediagnostik eignen, liegt der innovative Aspekt dieses Projektes in der Etablierung einer neuen für den Patienten nichtinvasiven Untersuchungstechnik für eine verbesserte Diagnostik der Lyme Borreliose. Damit können einerseits die Unsicherheit bei Arzt und Patient reduziert werden, und, wirtschaftlich gesehen, Einsparungen bei der Durchführung sinnloser Antibiotikatherapien vorgenommen werden.

Die Lyme Borreliose (LB) ist eine Multisystemerkrankung mit beträchtlicher Morbidiität. In diesem Projekt wurde die molekulare Diagnose einer LB aus dem Harn neu etabliert. Es zeigte sich, dass diese sensitiver ist als herkömmliche serologische Methoden für die Diagnose eines Erythema migrans, der Erstmanifestation der LB. Serologische Tests sind bis jetzt unzulänglich, da sie nur in ca 50% eine aktuelle Infektion bestätigen können und für die Beurteilung eines Therapieerfolges auch ungeeignet sind. Der Nachweis von Borrelia burgdorferi-DNA im Harn ist eine innovative Untersuchungstechnik, die weltweit, allerdings nicht routinemäßig, und an einem heterogenen Krankengut durchgeführt wurde. Ihre Wertigkeit ist noch umstritten, da Unterschiede in der Auswahl der Primer sowie Unterschiede in Extraktionsmethoden widersprüchliche Ergebnisse dieser Untersuchungen ergeben haben. Es bestand auch die Schwierigkeit, die Daten zu reproduzieren. Ziel unseres Projektes war es, diese Untersuchungsstechnik im Detail zu analysieren. Es wurde dabei erkannt, dass verschiedene Untersuchungsschritte, die der PCR vorausgehen, essentiell waren, um positive Ergebnisse an Patientenharnen zu erhalten. Wir fanden bei 80% der Patienten mit Erythema migrans, der frühen LB, eine positive Harn PCR, die bis zu 6 Monate nach antibiotischer Therapie in abfallender Häufigkeit nachweisbar war. Für die Nested PCR verwendeten wir die Flagellin Primer BBSCH 1, 2 / Fl 7, 59. Die Amplifikate wurden auf Agarose Gel dargestellt und durch Hybridisierung mit einem DNA-Enzym Immunoassay spezifiziert. Waren die Harnproben länger als 3 Monate eingefroren, senkte sich die Sensitivität der Harn PCR auf 25-30%. Wichtig für eine positive PCR waren ferner die Zentrifugation bei 36.000 x g, die Extraktion mit DNAzol und das Vermeiden der Untersuchung des Morgenharns, da wir herausfanden, dass am Morgen am wenigsten, am Abend am meisten Borrelien DNA im Harn nachweisbar war. Die Harn PCR wurde bei 126 Patienten mit Erythema migrans und 21 mit Acrodermatitis chronica atrophicans in Serienuntersuchungen durchgeführt, ferner bei Patienten mit Arthritis (hier wurde auch die Synovialflüssigkeit untersucht), Neuroborreliose, Patienten mit verschiedenen Dermatosen und Gesunden insgesamt in 891 Harnen. Eine beträchtliche Zahl an Kontrollpatienten, vor allem solche mit neurologischen und muskuloskelettalen Symptomen, sowie solche mit sklerosierenden dermatologischen Krankheitsbildern, bei denen in den letzten Jahren bereits eine Assoziation zur Lyme Borreliose nachgewiesen werden konnte, zeigten eine positive Harn PCR im Vergleich zu 3,5% der Gesunden. Unsere detaillierten Laboranalysen bestätigten, dass die Harn PCR einen diagnostischen Wert hat nicht nur bei der Diagnostik der frühen LB sondern vor allem bei seropositiven und seronegativen Patienten mit unklaren Krankheitsbildern, die der LB zugeordnet werden, besonders bei seropositiven Patienten mit Arthritis/Arthralgien, um die Notwendigkeit einer antibiotischen Therapie zu begründen. Der Borrelien-DNA Gehalt im Harn ist aber niedrig, sodass die Harn PCR nach einem genauen Protokoll durchgeführt werden muß. Borrelien-DNA ist bis zu 6 Monate nach antibiotischer Behandlung im Harn nachweisbar. Wir vermuten, dass es sich dabei um nicht- infektiöse, leblose Bakterien oder deren Bruchstücke handelt, die eine bestimmte Zeit nach antibiotischer Therapie weiter ausgeschieden werden, ohne eine klinische Symptomatik zu machen. Zusammenfassend betrachten wir die Harn-PCR als wertvolle, nicht-invasive Untersuchungsmethode, die für die Diagnostik einer akuten, behandlungsbedürftigen LB von Bedeutung ist, was medizinisch und ökonomisch Vorteile bringen kann. Unnotwendige Antibiotikatherapien können damit vermieden werden.