Cellulose-abhängige Signaltransduktion in Trichoderma reesei

Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) ist ein Pilz, der seit dreißig Jahren zur industriellen Produktion von Cellulose-abbauenden Enzymen eingesetzt wird. In jüngeren Jahren werden auch die Promotoren seiner Cellulasegene zur Produktion rekombinanter Proteine (z.B. Antikörper, Chymosin, Plasminogen-Aktivator) verwendet. Unsere Arbeitsgruppe beschäftigt sich seit mehr als zehn Jahren mit den biochemischen Grundlagen der Stimulierung der Cellulase-Genexpression durch Cellulose. Unsere gegenwärtigen Kenntnisse, erarbeitet am cbh2 (die Cellobiohydrolase II-kodierenden) Modellgen erlauben die Formulierung eines Modells, in dem zwei Gruppen von DNA-bindenden Proteinen - ein HAP2/HAP3/HAP5-Komplex, sowie ein spezifischer Transkriptionsfaktor - konstitutiv an ein für die Induktion essentielles Dekamer binden, und damit die Kontaktoberfläche für ein die Induktion vermittelndes weiteres Protein bilden. Im Rahmen früherer FWF-Projekte verfügen wir über die Gene für HAP2/HAP3 und HAP5, sowie das zweite DNA-bindende Protein. In Fortführung der bisherigen Strategie planen wir im gegenwärtigen Projektantrag, die an der Cellulose-Signaltransduktion weiteren beteiligten Gene zu klonieren, wobei wir zwei verschiedene Strategien vorschlagen: das Gen des den konstitutiv vorhandenen Transkriptionskomplex kontaktierenden Proteins soll mit Hilfe des Yeast Two Hybrid Systems (unter Ausnützung seiner Bindung an die Protein des Komplexes) kloniert und charakterisiert werden; weitere, unbekannte Komponenten der Signaltransduktion sollen mit Hilfe der jüngst für Pilze entwickelten REMI Mutagenese (eine Methode die primär Mutanten isoliert, aus denen jedoch das defekte Gen leicht kloniert werden kann) kloniert werden. Wir schlagen zu diesem Zweck eine genetische Methode vor, mit der sowohl Cellulase-negative als auch Cellulase-, konstitutive Mutanten erhalten werden können. Durch eine erfolgreiche Bearbeitung des vorgeschlagenen Projekts sollte wir über eine Sammlung von Genen verfügen, deren Charakterisierung uns einen Einblick in den Cellulose-Sidnaltransduktionsweg ermöglichen sollte.

In diesem Projekt wurden molekulare Strategien angewandt, um zu erfahren wie der filamentöse Pilz Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei) bei Anwesenheit von Cellulose sein Cellulasegen-System induziert. Zu diesem Zweck wurden zwei Strategien angewandt: mittels des sogenannten One Hybrid System sollten Proteine identifiziert werden, die an die Sequenz GTAATA innerhalb des CAE Motivs im cbh2-Promoter von Hypocrea jecorina binden, für welche bereits früher die Beteiligung an der Cellulase-Genexpression nachgewiesen werden konnte. Die daraus erhaltenen 10 Klone, die die gestellten Bedingungen erfüllten, wurden näher untersucht: einige davon zeigten Homologie zu Transkriptionsfaktoren von oft nahe verwandten Organismen, und zu Genen, die in keinem direkten Zusammenhang mit der Aktivierung der Transkription stehen, aber mit dem an der Genregulation beteiligten Proteinkomplex zusammenwirken. Einer dieser Klone zeigte unterschiedliche Expression zwischen dem Wildtypstamm und einer Cellulase-negativen Mutante und wurde daher weiteren Analysen unterzogen. Die zweite Strategie verwendete die Rapid Subtraction Hybridization (RaSH) zur Identifizierung von Genen deren Expression im Wildtypstamm im Vergleich zum zellulase-negativen Stamm unter induzierenden Bedingungen stark erhöht ist. Dabei wurden 23 Gene gefunden, einige davon mehrmals: die meisten kodieren für bisher noch unbekannte Gene, aber bei manchen wurden auch Ähnlichkeiten zu Transkriptionsfaktoren oder Proteinen, die an der Signaltransduktion beteiligt sind aufweisen, gefunden. Diese unterschiedliche Expression wurde durch Northern blots bestätigt und die chromosomale und die cDNA Sequenz der interessantesten Klone isoliert und untersucht. Die funktionelle Involvierung eines dieser Proteine (envoy) in der Cellulasegenexpression wurde durch Konstruktion von knock-out Mutanten nachgeiwiesen. In diesem Projekt wurden daher zum ersten Mal Komponenten der Signaltransduktion durch Cellulose identifiziert, was weitere Arbeiten zu diesem Thema ermöglicht.