Proteinphosphatase 2A-assoziierte Proteine

Proteinphosphatase 2A (PP2A) ist eine hochkonservierte Serin/Threonin-Phosphatase, die an der Regulation vieler zellulärer Prozesse wie z.B. der Signalübertragung und des Zellzyklus, beteiligt ist. Intrazelluläres PP2A besteht aus einem Heterodimeren zwischen einer katalytischen, 36kDa (als C bezeichneten) und einer konstanten regulatorischen 63kDa (als A bezeichneten) Untereinheit. Zusätzlich enthält dieser Komplex noch eine von mehreren, regulatorischen Untereinheiten, die als B, B`, B" bezeichnet werden. Die Interaktion mit den regulatorischen Untereinheiten moduliert die Substratspezifität und Aktivität der katalytischen Untereinheit. Z.B. verstärkt die regulatorische B-alpha-Untereinheit die PP2A Aktivität gegenüber Substraten wie cdc2- phosphoryliertem Histone H1, einem Substrat, das häufig für in vitro Experimente verwendet wird, das aber höchstwahrscheinlich kein in vivo Substrat von PP2A ist. Die Beteiligung der B-Untereinheit an vielen intrazellulären Vorgängen weist daraufhin, daß die Funktion der B Untereinheit darin bestehen könnte, das AC Heterodimere zu den verschiedenen Substraten zu bringen. Die Drosophila Mutanten aar (abnormal anaphase resolution) und twins, die Mutationen. in den Allelen der B Untereinheit besitzen, zeigen mitotische Defekte. Die Deletion der homologen B-Untereinheit in der Hefe Saccharomyces cerevisiae führt zu einer abnormen Morphologie der Knospen, zu Defekten der Zellwand und zu einem Defekt im Kontrollmechanismus des Spindelaufbaus. Mögliche Substrate, die durch die Abwesenheit der B- Untereinheit in den Drosophila und Hefe-Mutanten beeinträchtigt wurden, konnten bis heute noch nicht identifiziert werden. In Säugertierzellen ist ein defekter Kontrollmechanismus des Spindelaufbaus assoziiert mit chromosomaler Instabilität. Chromosomale Instabilität fährt zu einer Veränderung der Chromosomenanzahl (Aneuploidie), einem charakteristischen Merkmal von Krebszellen. Die Rolle und Funktion der B-Untereinheit bei der Ausführung des mitotischen Kontrollmechanismus ist noch nicht aufgeklärt, hauptsächlich weil die intrazellulären Angriffspunkte/Substrate eines PP2A Komplexes, der die B-Untereinheit enthält, unbekannt sind. Wesentliches Ziel des geplanten Projekts ist es daher, Proteine, die mit der regulatorischen B-Untereinheit interagieren, zu identifizieren und zu klonieren. Die weitere Charakterisierung dieser Proteine soll klären, ob es sich um potentielle Substrate oder auch um Regulatoren von PP2A und der B-Untereinheit handelt. Das geplante Projekt wird in der Identifizierung der intrazellulären Angriffspunkte von PP2A und in der Aufklärung der Rolle und Funktion der B-Untereinheit von Säugem ein Schritt vorwäts sein.

Fehlfunktionen von Proteinphosphatase 2A (PP2A), einer hochkonservierten Serin/Threonin-Phosphatase, spielen eine bedeutende Rolle in der Genese von Erkrankungen des Menschen, wie z.B. Krebs und Alzheimer. PP2A Holoenzyme bestehen aus einer katalytischen C Untereinheit, die mit einer als A bezeichneten Gerüstuntereinheit interagiert und in Folge noch mit einer von mehreren, regulatorischen B Untereinheiten, die das AC-Heterodimer zu den verschiedenen Substraten leiten. Wesentliches Ziel des Projekts war es, neue Proteine, die mit der regulatorischen B-Untereinheit interagieren, zu identifizieren und zu klonieren Wir isolierten in einem "Two-Hybrid Screen" mit der regulatorischen Ba/PR55 Untereinheit ein Protein, das wir aufgrund seiner Homologie zu dem C.elegans HCP-6 Protein als hHCP-6 bezeichneten und das entfernt verwandt ist mit hCAP-D2, einer Kondensin-Untereinheit. Kondensin bezeichnet einen Proteinkomplex, der für die Kondensation und die Aufteilung von Chromosomen in der Mitose notwendig ist. Wir konnten zeigen, dass hHCP- 6 Bestandteil eines neuen Kondensin-ähnlichen Komplexes ist, der in der Mitose an Chromosomen bindet und von PP2A in einer von Ba/PR55- abhängigen Weise dephosphoryliert wird. Interessanterweise gab es bereits Hinweise auf eine mögliche Rolle von Ba/PR55 bei der Aufteilung von Chromosomen in der Mitose. Z.B. verursacht die Deletion von CDC55, dem Ba/PR55 homologen Gen in der Hefe, einen Defekt im Kontrollmechanismus des Spindelaufbaus, d. h. dass sich diese Hefemutanten trotz des Fehlens einer intakten Mitosespindel teilen - mit letalen Konsequenzen; einem Phänotyp übrigens, der auch bei Hefestämmen beobachtet wird, denen RRD1 und 2, die Hefe-Homologen von PTPA (Phosphotyrosyl-Phosphatase-Aktivator), einem Protein mit unbekannter intrazellulärer Funktion, fehlen. Wir konnten zeigen, dass der dem Phänotyp dieser Stämme zugrundeliegende Defekt nicht an dem Unvermögen Ba/PR55-Holoenzyme zu bilden beruht, sondern an der Unfähigkeit, die active und spezifische Form der katalytischen PP2A Untereinheit zu bilden. PTPA/RRD scheint eine essentielle Funktion für die Biogenese von PP2A zu erfüllen. Im Rahmen des Projektes stellten wir Antikörper gegen PP2A-Untereinheiten und PP2A-bindende Proteine her, die für die Durchführung des Projektes notwendig waren. Ich schloss mit 2 Firmen Lizensierungsverträge über die Kommerzialisierung dieser Antikörper ab. Das Projekt war somit nicht nur in wissenschaftlicher, sondern auch in kommerzieller Hinsicht erfolgreich. Unsere Arbeit repräsentiert zurzeit "nur" einen Beitrag zur Grundlagenforschung, könnte aber gleichzeitig als Basis für die Entwicklung therapeutischer Konzepte zur Behandlung von Krankheiten, die durch PP2A-Fehlfunktionen verursacht werden, dienen.