Intracelluläre Bewegungen und Motor Proteine in Desmidiaceen

Das beantragte Projekt baut auf Ergebnissen früherer Untersuchungen auf, die im Rahmen von vorhergehenden FWF-Projekten über Funktion, Struktur und Verteilung von Cytoskelettelementen unter Anwendung verschiedener zellbiologischer und biochemischer Methoden an einzelligen Grünalgen aus der Familie der Desmidiaceen von der Gruppe der Antragstellerin erzielt wurden. Ziel des neuen Projektes ist es, anhand von außergewöhnlichen Bewegungsprozessen die in Desmidiaceen wie Micrasterias, Pleurenterium und Closterium ablaufen, wie z.B. verschiedenen speziellen Zellkern -und Chloroplastenbewegungen durch experimentelle Eingriffe und immuncytochemische Reaktionen allgemeingültige Aufschlüsse über die Steuerung intrazellulärer Bewegungen in Pflanzen und die Beteiligung von Motorproteinen zu gewinnen. Folgende Fragestellungen sollen im Laufe des Projektes behandelt werden: Welche Motorproteine sind an intrazellulären Bewegungen der genannten Algen beteiligt? Wo sind die Motoren in den einzelnen entwicklungsabhängigen Phasen der Bewegung lokalisiert? Wie wird die Aktivität des entsprechenden Motors gesteuert? Ist es möglich. mit molekularbiologischen Methoden, die bisher bei Desmidiaceen noch nicht angewendet wurden, Aufschlüsse über die biologische Bedeutung von Myosinen bei Micrasterias zu gewinnen? Sind die Mikrotubuli-Zentren, die bisher im Zusammenhang mit Kernmigrationen elektronenmikroskopisch beschrieben wurden tatsächlich Mikrotubuli-organisierende Zentren? Wie verändert sich die Verteilung von Aktin und Myosin wenn die Zelle ihr Plasmaströmungsmuster ändert? Wie sind Mikrotubuli und Alktinfilamente während der einzelnen Mitosestadien angeordnet? Welche Motoren sind an der Mitose von Micrasterias beteiligt? Die Klärung dieser Fragen soll einerseits durch den Einsatz verschiedener Inhibitoren, Mikroinjektion von Antikörpern, Beeinflussung des Ionenhaushalts und der Phosphorelierung verbunden mit genauen Messungen der Bewegung in vivo erfolgen. Andererseits soll durch Immunodetektion am Western Blot versucht werden mögliche Motorproteine wie Myosin, Kinesin, Dynein oder Dynamin mit verschiedenen Antikörpern nachzuweisen und in einem zweiten Schritt am Ultradünnschnitt nach Hochdruchgefrierfixierung in den einzelnen Stadien der Bewegung zu lokalisiert. Alle für die Versuche nötigen Methoden wurden bereits an den Untersuchungsobjekten erprobt bzw. in den vorhergehenden Projekten für Desniidiaceen adaptiert. Im Rahmen einer internationalen Kooperation sollen in einem Teilbereich des Projektes erstmalig molekularbiologische Methoden bei Desmidiaceen erprobt werden. Die nötige instrumentelle Ausstattung für die geplanten Versuche ist im wesentlichen am Institut für Pflanzenphysiologie der Universität Salzburg gegeben, eine unabdingbare Erfordernis für die Durchführung des Projektes ist jedoch die Gewährung einer ganztägigen Post-doc Position und einer Laborantenstelle sowie Mittel für Verbrauchsmaterial.

Im Rahmen dieses dreijährigen Projektes wurde am Beispiel verschiedener Grünalgen, die als Modellsyteme dienten, untersucht, welche Proteine als "Motoren" an Bewegungsvorgänge, wie Zellkern- und Chloroplastenwanderungen sowie Cytoplasmaströmung beteiligt sind, um damit Aufschluss über Kraftentstehung bei intrazellulären Bewegungen in Pflanzenzellen zu gewinnen. Im Laufe des Projektes an dem neben der Projektleiterin ein Postdoc und eine halbtags beschäftige Laborantin mitarbeiteten, wurden verschiedene Bewegungsabläufe untersucht, die alle unter Beteiligung bestimmter filamentöser Proteinstrukturen, wie Aktinfilamente oder Mikrotubuli, erfolgen. Dies sind z.B. geradlinige Kernbewegung während des Zellwachstums der Alge Micrasterias und die kreisförmige Kernbewegung in Pleurenterium, bei der sich der Kern über mehrere Stunden mit zunehmender Geschwindigkeit um das Zellzentrum der bereits vollständig entwickelten Zelle bewegt. Darüber hinaus standen Chloroplastenbewegungen, Bewegungsabläufe bei der Kernteilung sowie das Zustandekommen der Cytoplasmaströmung, die bei dieser Algengruppe je nach Entwicklungsstadium in unterschiedlichen Strömungsmustern abläuft, im Mittelpunkt der Untersuchungen. Biochemische, immuncyotochemische und immun-elektronenmikroskopische Untersuchungen haben ergeben, dass für das Zustandekommen der geradlinigen Kernbewegung in Micrasterias zwei verschiedene "Motoren" in Frage kommen, nämlich ein Kinesin-artiges Protein, das die bewegende Kraft für das Mikrotubulisystem um den Kern bildet und ein Myosin-artige Protein, das an die Aktinfilamente bindet. Die Ergebnisse wurden durch den Einsatz spezifischer Inhibitoren in lebenden Zellen bestätigt. Ein Ausschalten des Kinesin-Motors führte zu einem völligen Stillstand der Kernbewegung, während ein Hemmung des Myosin-Motors die Kernbewegung zwar auch beeinträchtigte aber nicht vollständig stoppte. Der Myosin-Inhibitor führte darüber hinaus aber auch zu gravierenden Veränderungen der Zellformbildung und der Cytoplasmaströmung. Aufwendige digitale Zeitraffungsanalysen an lebenden Zellen in Kombination mit immun-biochemischen Studien haben gezeigt, dass an der kreisförmigen Kernbewegung der Alge Pleurenterium zwei verschiedene Mikrotubuli- "Motoren" beteiligt sind, jedoch kein Aktin-"Motor". Sowohl Kinesin-artige Proteine, als auch Dynein-artige Proteine wurden in Extrakten der Algen nachgewiesen. Untersuchungen der Auswirkung verschiedener spezifischer Inhibitoren auf den Bewegungsablauf legten nahe, dass Dyneinen dabei die bedeutendere Rolle für das Zustandekommen der bewegenden Kraft zukommt, während Kinesine offenbar dafür verantwortlich sind, den Zellkern in seiner Umlaufbahn zu halten. Durch den erstmaligen Einsatz einer, für die Zellbiologie neuen Stoffklasse, den Chondramiden, die als Anti- Pilzmittel und Cytostatika Anwendung finden und die die Polymerisation von Aktinfilamenten fördern, konnten während des Projektes wichtige Erkenntnisse über die Funktion von Aktinfilamenten für intrazelluläre Bewegungsabläufe erzielt werden. Außerdem wurden während eines Forschungsaufenthaltes eines Projektmitarbeiters an der Universität Jena Laserpinzetten und fokussierte Laser-Mikrostrahlen eingesetzt, um Aufschlüsse über Kraftentstehung und mechanische Eigenschaften der Organellenbahnen während des Bewegungsablaufes zu erzielen.