Neurale Kohlehydratepitope in wirbellosen Tieren

Forschungsprojekt P 13810Neutrale Kohlenhydrat-Epitope in wirbellosen TierenIain Benedict Howe WILSON28.06.1999 Schon seit geraumer Zeit erscheinen Berichte, daß IgG oder auch IgE Antikörper gegen pflanzliche Glykoproteine mit Glykoproteinen von Insekten kreuzreagieren. So sind insbesondere Antikörper gegen Kren-Peroxidase zu einem bewährten Mittel zur Markierung von Neuronen in Drosophila und in Heuschrecken geworden. Vor kurzem wurde auch gezeigt, daß bestimmte Nervenzellen von Caenorhabditis elegans damit gefärbt werden können. Die strukturelle Grundlage dieser Kreuzreaktion wurde allerdings in keinem dieser Fälle aufgeklärt. Es gibt allerdings Hinweise darauf, daß die jener Anteil des Anti-Peroxidase Serums dafür verantwortlich ist, der gegen Kohlenhydrat-Epitope gerichtet ist. Um die Ursache dieser spezifischen Neuronen-Anfärbung zu ergründen, wollen wir die Struktur und die Biosynthese der Asn-gebundenen Oligosaccharide in Drosophila und Caenorhabditis bestimmen. Besonderes Augenmerk wird dabei auf potentielle kreuzreagierende Determinanten, wie z.B. die "core "-alpha1,3-gebundene Fukose gerichtet. Diese Modifikation wurde bis dato in Pflanzen, Insekten und Helminthen gefunden. Mittels Immunaffinitätschromatographie sollen kreuzreaktive Glykoproteine isoliert und mittels MALDI und BPLC deren Glykane und Peptidmuster analysiert werden. Darüber hinaus werden versuchen, das Gen für "core"-alpha1,3-Fukosyltransferase in Drosophila zu finden, zu klonieren und rekombinant zu exprimieren. Wir werden die Aktivität dieses Enzyms in Extrakten von Drosophila und Caenorhabditis bestimmen. Die immunologische Kreuzreaktion von Drosophila und Caenorhabditis Proteinen mit Anti-Peroxidase Serum soll durch Inhibition mit Neo-Glykokonjugate, die mithilfe der rekombinanten "core"-alpha1,3-Fukosyltransferase synthetisiert wurden, untersucht werden.

Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist ein wichtiger Modellorganismus für Studien die sich mit der morphologischen Entwicklung der Tiere beschäftigen. In mehreren Versuchsansätzen untersuchten wir Glykoproteine von Drosophila-Nervenzellen auf das Vorkommen von Glykanstrukturen wie sie in Pflanzen vorkommen. Ausgangspunkt war das Bindungsvermögen des Anti-Krenperoxidase Antikörpers der diese Struktur erkennt und allergene Proteine sowohl von Pflanzen alsauch von Insekten bindet. Diese erwartete Glykanstruktur als auch das für dessen Bildung notwendige Enzym (eine alpha-Fukosyltransferase) konnte nachgewiesen werden. Wir haben nachgewiesen, daß die Fukosyltransferase diese fukosylierten Strukturen auch in vitro herstellen kann. In einer Drosophila-Nervenzell-Linie konnte die Bindung zu dem Anti-Krenperoxidase Antikörper mit doppelsträngiger RNA gegen codierende Teile der Fukosyltransferasegens unterbunden werden. Die untersuchten Glykanstrukturen eines weiteren Modellorganismus Caenorhabditis elegans, die ebenfalls von Anti-Krenperoxidase Antikörper erkannt wurden, stellten sich als sehr komplex dar. Eine unerwartete Tatsache ist daß die Nematodenglykane viel komplziertere Strukturen aufweisen als die der höherentwickelten Fruchtfliege. Einige weitere Fliegenglykosyltransferasen wurden untersucht wie z.B. Xylosyltransferase das Startenzym für die Proteoglykane, die eine bedeutende Rolle in der morphologischen Entwicklung spielen.