Schnupfenvirus Bindungsinhibitoren

Forschungsprojekt P 14503Schnupfenvirus BindungsinhibitorenDieter BLAAS09.10.2000 Rhinoviren des Menschen (HRVs), die Hauptverursacher von Schnupfen und Heiserkeit, existieren in Form von mehr als einhundert verschiedenen Serotypen. Trotz dieser Diversität gibt es nur drei verschiedene Rezeptoren, die den Eintritt der Viren in die Wirtszelle vermitteln. Einundneunzig Serotypen binden an das intercellular adhesion molecule 1 (die major group) und zehn Serotypen an Mitglieder der low-density lipoprotein Rezeptor (LDLR) Familie (die minor group); als einzige Ausnahme verwendet HRV87 ein uncharakterisiertes Glycoprotein für die Zellbindung. Obwohl die viralen Serotypen einander in Bezug auf Kapsidstruktur, Genomorganisation und die Symptome der verursachten Erkrankung einander ähneln, sind die Rezeptoren strukturell und funktionell nicht miteinander verwandt. In vorausgehenden Arbeiten haben wir die minimalen strukturellen Erfordernisse von LDLR in Bezug auf Erkennung des Virus und auf Inhibition der virusinduzierten Zellschädigung mit Hilfe von rekombinanten 1öslichen Minirezeptoren definiert. Fragmente verschiedener Vertreter der LDLR Familie wurden mit hoher Ausbeute in Sf9 Insektenzellen und in Bakterien exprimiert und in vitro zur nativen Konformation gefaltet. Im Rahmen des vorgeschlagenen Projektes sollen kleine Rezeptorfragmente (mit ein, zwei oder drei complement type A repeats) aus verschiedenen Mitgliedern der LDLR Familie als Fusionsproteine mit dem M13 P3 Bindungsprotein exprimiert werden um ein phage display` zu ermöglichen. Geeignete Stellen in diesen Proteinen sollen dann einer Zufallsmutagenese unterworfen werden und rekombinante Phagen im Hinblick auf höchste Affinität gegenüber minor group Viren selektiert werden. Mit derselben Technologie soll die lineare Abfolge und Kombination individueller Ligandenbindungs-repeats geändert werden und die, durch die neuen Kombinationen entstandenen Rezeptoren, auf Affinität und Spezifität gegenüber Rhinoviren und anderen Liganden untersucht werden. Derartige Rezeptorderivate mit künstlich erhöhter Affinität können als wichtiger Ausgangspunkt für die Entwicklung antiviral aktiver Verbindungen dienen und werden es erlauben, die Kontaktstellen. zwischen viraler Oberfläche und Rezeptormolekül zu identifizieren. Die Untersuchung der Interaktion mit anderen Liganden wird es ermöglichen, die Basis der spezifischen Erkennung verschiedener Liganden zu ermitteln.

Mehr als 50% aller milden respiratorischen Erkrankungen, dem Schnupfen, werden durch Rhinoviren (HRVs) verursacht. Die Infektion beginnt mit der spezifischen Bindung an zelluläre Rezeptoren; die Viren werden daraufhin in die Zelle transportiert und das RNA Genom wird ins Zytoplasma entlassen, worauf die Replikation einsetzt. Nach Zerstörung der Zelle werden neue Viren freigesetzt die einen weiteren Replikationszyklus in benachbarten Zellen beginnen. Die Blockierung des allerersten Kontaktes zwischen Virus und Zelle ist daher eine effiziente Methode um die Infektion zu verhindern. Wir haben deshalb damit begonnen die Interaktion zwischen Rhinoviren und deren Rezeptoren zu untersuchen. Der Grossteil unserer Arbeit wurde mit HRV2, das zur kleinen Rezeptorgruppe gehört, durchgeführt. HRVs dieser Gruppe benutzen verschiedene Vertreter der low-density lipoprotein receptor (LDLR) Familie um Zugang in die Zelle zu erlangen. Im Gegensatz zu anderen Virusrezeptoren besteht die Ligandenbindungsdomäne der LDLR Familie aus einer unterschiedlichen Anzahl kurzer Module mit ähnlicher aber nicht identischer Sequenz. Unter Verwendung eines rekombinanten Rezeptorfragmentes, das nur die Module 2 und 3 umfasst, haben wir die erste jemals gelöste Struktur eines Virus-Rezeptorkomplexes mit atomarer Auflösung erhalten. Die Struktur zeigt ein kompliziertes Netzwerk hydrophober und ionischer Interaktionen. In allen HRVs, die zur kleinen Rezeptorgruppe gehören, kommt einem Lysinrest eine zentrale Bedeutung zu. Es interagiert mit einem in den meisten Ligandenbindungsdomänen konservierten Tryptophan und einem ebenfalls konservierten Cluster aus sauren Resten, die ein Ca-Ion komplexieren. Die Anordnung der Module auf der Virusoberfläche deutete stark darauf hin, dass mehrere Module eines einzigen Rezeptormoleküls simultan binden könnten. Dies wurde mittels eines künstlichen rekombinanten Concatemers von VLDLR Module 3 (V33333) bestätigt das eine ringförmige Struktur um jedes der 12 Spitzen des icosahedrischen Kapsids bildet. Diese außergewöhnliche Art der Interaktion erklärt die extrem starke Bindung von V33333 die sich in einer Blockierung der Virusbindung an die Zelle ausdrückt. Neueste Daten deuten auf die Möglichkeit hin, dass die Bindungsstärke mittels gerichteter Mutagenese der Rezeptormodule und durch Modifikation der Verbindungsglieder zwischen den Modulen noch um Vieles gesteigert werden kann. Auf diese Weise kann ein extrem starker Virusinhibitor geschaffen werden.