Histon-Deacetylasen aus Pflanzen

Forschungsprojekt P 14528Histon-Deacetylasen aus PflanzenPeter LOIDL09.10.2000 Das genetische Material liegt im eukaryontischen Zellkern als DNA-Protein-Komplex vor. Der Grundbaustein dieses Komplexes ist das Nukleosomen-Core-Partikel, das aus einem Histon-Oktamer besteht, um das die DNA in zwei kompletten Windungen gewickelt ist. Das Histon-Oktamer besteht aus je zwei Molekülen der Histone H2A, H2B, H3 und H4. Die Histone, bestehen aus einer freien N-terminalen Extension und einem sogenannten ,,Histone- Fold" Motiv, das für den Zusammenhalt des Oktamers verantwortlich ist. In den sehr konservierten N-terminalen Extensionen werden bestimmte Aminosäuren durch posttranslationale Modifikationen verändert. Die am besten untersuchte dieser Modifikationen ist die Acetylierung von _-Amino-Gruppen von Lysinen. Diese Modifikation wird durch Histon-Acetyltransferasen bewerkstelligt, wobei die Acetat-Reste durch Histon-Deacetylasen wieder abgespalten werden können, was bedeutet, dass diese Reaktion eine dynamische ist. Die funktionale Bedeutung der Histon-Acetylierung war bis vor kurzem unklar. Es wurde aber in den letzten Jahren gezeigt, dass sowohl Histon- Acetyltransferasen wie auch Histon-Deacetylasen Transkriptions-Regulatoren sind (Gcn5, Rpd3), die in der Hefe schon lange als solche identifiziert waren, obwohl man deren enzymatische Aktivität nicht gekannt hat. Wir haben unsere Forschungen in den letzten Jahren auf die Charakterisierung, Reinigung und molekulare Identifikation von Histon-Deacetylasen aus Mais-Embryonen konzentriert und konnten zeigen, dass in Pflanzen drei unterschiedliche Histon-Deacetylasen vorkommen, die zu unterschiedlichen Protein-Familien geh6ren: HD1-B (Rpd3-Homolog), das in zwei Formen existiert, nukleoläres; HD2, eine von uns erstmals beschriebene und identifizierte Deacetylase Familie, und HD1-A, ebenfalls ein Vertreter einer noch nicht in Eukaryonten identifizierten Deacetylase Familie. Das vorliegende Projekt schliesst unsere Forschungen auf diesem Gebiet vorläufig ab und versucht im Mais- System, das nach wie vor das im Hinblick auf Deacetylasen best untersuchteste System darstellt, das Zusammenspiel der verschiedenen Enzym-Typen zu verstehen. Im Rahmen des Projektes werden folgende Teilaspekte untersucht: 1) Die molekulare Klonierung und Sequenzierung von Mais HD1-A und einem Hefe-Hda1 Homolog, sowie einer NAD-abhängigen Deacetylase, die zu einem Hefe-Silencing Faktor (Sir2p) homolog ist; 2) die Analyse von Interaktionspartnern von nukleolärem HD2 aus Mais und Arabidopsis, bzw. die Interaktion von verschiedenen HD2-Subtypen im hochmolekularen HD2-Komplex; 3) Die Expression der verschiedenen Enzyme während der Embryo-Keimung in Mais und in verschiedenen Geweben und Organen von Pflanzen und 4) die Wirkung von Deacetylase-inhibitoren (cyclische Tetrapeptide und Trichostatin), bzw. der Infektion von Mais durch den HC-toxin bildenen Pilz Cochliobolus carbonum auf die Expression der an der Acetylierung beteiligten Enzyme. Die Resultate des Projektes sind nicht nur der entscheidende Schritt zum zusammenfassenden Verständnis der Enzyme in Mais, sondern auch ein wichtiger Beitrag für die Identifikation neuer Deacetylasen in nicht-pflanzlichen Organismen.

Das Genom enthält in Form der DNA die Information für den Aufbau von Zellen in Geweben und Organen. Während der Entwicklung eines Organismus bzw der Differenzierung von Zellen bestimmen weitere Informationselemente den funktionellen Zustand der Zelle. Diese "epigenetische" Information wird einerseits durch Methylierung der DNA selbst andererseits durch Anbringen von Signalen an nukleosomalen Histones des Chromatins eingebracht. Daraus hat sich die Bezeichnung "epigenetischer Histon Code" entwickelt, im Gegensatz zum genetischen Code der DNA. Posttranslationale Modifikationen von Histonen stellen ein zentrales Element des Histon Code dar. Die am besten untersuchte Modifikation ist die Acetylierung, die durch Histon-Acetyltransferasen und Deacetylasen katalysiert wird. Unsere Arbeitsgruppe hat 3 Vertreter von Histon-Deacetylasen in Mais- Embryos gereinigt und molekular identifiziert: die pflanzen-spezifische HD2 Familie, Vertreter der "klassischen" Rpd3-Familie und zuletzt ein HDA-homologes Enzym, ZmHDA1. Das zuletzt erwähnte ist insofern bemerkenswert, als dessen enzymatische Aktivität durch limitierte Proteolyse reguliert wird. Für alle 3 Vertreter konnten wir zeigen, dass sie die Transkription in Reporter-Gen Assays hemmen. Es gibt in Mais-Embryos eine weitere Deacetylase, einen Vertreter der NAD-abhängigen Sirtuine; diese tragen allerdings zu weniger als 5% der Histon-Deacetylase Aktivität bei und deacetylieren darüberhinaus in vitro nicht Histone sondern 2 hochmolekulare Proteine unbekannter Identität. Der bei weitem wichtigste Befund dieses Projektes ist die teilweise Aufklärung der Regulation von ZmHDA1. Dieses Protein wird als hochmolekulare Vorstufe mit einem apparenten Molekulargewicht von 84000 synthetisiert, ist jedoch enzymatisch inaktiv und wird durch proteolytische Abspaltung eines grossen C-terminalen Fragmentes, wahrscheinlich mit Hilfe eines 65 kD Intermediates, in das enzymatisch aktive 48 kD Protein überführt, welches als Monomer vorliegt. Das enzymatisch inaktive 84 kD-Vorläuferprotein ist Teil eines ca 300 kD grossen Komplexes, dessen Funktion momentan in unserem Labor untersucht wird. Alle beteiligten Proteine bzw Spaltprodukte sind zumindest teilweise phosphoryliert; die Phosphorylierung moduliert nicht nur die Aktivität des 48 kD Proteins sondern auch dessen Substratspezifität. Interessanterweise gibt es in Arabidopsis ein eigenes Gen, welches für ein kleines 252 Aminosäuren langes Protein kodiert, das hoch homolog zum abgespaltenen C-Terminus von ZmHDA1-p84 ist. Die Funktion dieses Proteins ist unbekannt. Die Regulation von ZmHDA1 durch limitierte Proteolyse stellt möglicherweise eine weitere pflanzen-spezifische Besonderheit von Elementen des Histon Code dar und deutet zum erstenmal eine Verbindung von Chromatin-Acetylierung und proteolytischen Vorgängen an.