Virusdynamik und Erkennung

Forschungsprojekt P 14549Virus-Dynamik und -ErkennungPeter HINTERDORFER09.10.2000 Die Entwicklung von effektiven Pharmaka gegen menschliche Rhinoviren, die die haupsächliche Ursache für Kälteinfektionen sind, ist wegen der großen Anzahl von verschiedenen Serotypen immer noch eine große Herausforderung. Ein besseres Verständnis des Bindungsmechanismus von (i) Viren an Zellen oder Zellrezeptorn und von (ii) Pharmaka an Zellen ist dabei von zentraler Bedeutung. Die Dynamik des viralen Kapsids ist essentiell für die räumlich und zeitlich konzertierte Abfolge der Ereignisse im viralen Zyklus. Das Binden des Virus an die Zelle, der Eintritt in die Zelle und das Einschleusen der Nukleinsäure sind notwendigerweise von Konformationsänderungen der Kapsidproteine und von dynamischen Veränderungen der Kapsidstruktur begleitet. In diesem Antrag addressieren wir Studien der molekularen Wechselwirkungen von Virus-Zell Erkennung und Pharmaka-Virus Bindung simultan mit Untersuchungen zur viralen Dynamik. Dies sollte wertvolle Einblicke in die Prozesse der viralen Infektion und Pharmakawirkung geben. Als Untersuchungungsmethode wird dabei dynamische Kraftmikroskopie mit dem Atomkraftmikroskop angewandt. Damit ist es möglich, die Molekulardynamik von biologischen Prozessen an einzelnen Bio-Molekülen in ihrer nativen Umgebung mit hoher lateraler Auflösung zu verfolgen. Das Potential von hoher Kraftauflösung (pN) und schnellem Respons (ms) ermöglicht die Detektion von Molekülfluktuationen und dynamischen nanornechanischen Veränderungen auf biologischen Proben. Zusätzlich werden mit Liganden und Pharmaka, die an die Spitze des Atomkraftmikroskopes gebunden sind, Einzelmolekül-Experimente zur Rezeptor-Liganden Erkennung und zur Pharmaka-Rezeptor Bindung durchgeführt. Dies wird neue Erkenntnisse über die Molekulardynamik des Erkennungs- und Bindungsprozesses von Rezeptorn und Pharmaka an Viren liefern.

In diesem Projekt wurden Methoden der Rasterkraftmikroskopie (RKM), das topographische Abbilden, sowie die Erkennungskraft-Spektroskopie und -Mikroskopie, auf den Schnupfenvirus Human Rhino Virus 2 (HRV2) angewandt. Dabei war die Entwicklung von Oberflächenchemie-Techniken für das Funktionalisieren der RKM-Spitzen der erste wichtige Schritt. Mittels der Spacer-Technologie wurden verschiedene Antikörper kovalent an Rastersondenmikroskop-Spitzen gebunden. Es ist uns gelungen, deren molekulare Erkennung mit dem Virus an der Oberfläche auf Einzel-Molekül-Niveau zu detektieren. Antikörper/Virus Bindungskräfte und die Dynamik der Erkennung wurden in Kraft-Spektroskopie Experimenten addressiert. Für kraftspektroskopische Untersuchungen von Zellrezeptor-Molekülen mit Viren wurden die Rezeptor-Moleküle die RKM-Spitze gebunden. Einzel-Molekül- Bindungsstärken wurden für rekombinante Rezeptor-Fragmente mit einer variablen Anzahl von Bindungs- Domänen gemessen, nämlich V1-8 (mit allen 8 Modulen), V1-3 (mit den ersten 3 Modulen), V33 und V333 (Konkatamere von Modul 3). V1-8 zeigte eine stärkere Wechselwirkung als V 333 , die anderen beiden Konstrukte zeigten eine vergleichsweise schwache Wechselwirkung. Aus der Abhängigkeit der Kräfte von der Beladungsrate wurden außerdem die thermische Dissoziationskonstante, koff , und xß, die Länge der Aktivierungsbarriere, gemessen. Das Binden der Rezeptor-Fragmente an den Virus konnte auch in Atomkraftmikroskopie-Topographie- Bildern gemessen werden. Diese Technik erlaubte es auch, die Freisetzung der RNA aus dem Virus zu verfolgen. Es wurde bei diesen Messungen eine laterale Auflösung von etwa zwei Nanometern erreicht. Damit konnten auch Substrukturen auf der viralen Proteinhülle aufgelöst werden. Es zeigte sich, dass die Protein-Schleifen in einem quasi-hexagonalen Pattern arrangiert sind. Parallel dazu haben wir ein statistisches Modell zur Rezeptor/Virus Bindung aufgebaut und die theoretischen Aussagen mit den experimentellen Daten verglichen.