Supramolekulares Design von funktionalisierten S-Schichten

Forschungsprojekt P 14689Supramolekulares Design von funktionalisierten S-SchichtenMargit SRA09.10.2000 Kristallin geordnete Protein- oder Glykoproteinschichten (S-Schichten) stellen die äußerste Zellgrenzfläche bei vielen Bakterien und Archaea dar. S-Schichten sind aus identen Protein- oder Glykoprotein-Subeinheiten aufgebaut. Isolierte S-Schicht-Subeinheiten besitzen vielfach die Fähigkeit, an festen Oberflächen, wie Edelmetallen, Silizium oder Glas, an gespreiteten Lipidfilmen oder an Liposomen, in hochgeordnete Monoschichten zu rekristallisieren. Aufgrund der anisotropen Eigenschaften der S-Schicht-Proteine hängt die Orientierung der Monoschichten sowohl von den physikochemischen Eigenschaften des Trägennateriales (Hydrophobizität und Ladung), wie auch von den Versuchsbedingungen (pH-Wert der Lösung, Art und Konzentration von Kationen) ab. Dies ist ein großer Nachteil, wenn rekombinant hergestellte S- SchichtFusionsproteine oder rekombinante S-Schicht-Proteine mit inserierten funktionellen Peptidsequenzen für die Rekristallisation zum Aufbau von hochgeordneten Affinitätsmonoschichten verwendet werden. Da der N-terminale Teil von S-Schicht-Proteinen, der vielfach S-layerhomologe-(SLH)-Motive aufweist, ein in das Peptidoglykangrundgerüst eingelagertes sekundäres Zellwandpolymer als Bindungsstruktur erkennt, soll dieses zum Funktionalisieren von verschiedensten Oberflächen genutzt werden, um die Bindung und Kristallisation von fiinktionellen S-Schicht-Proteinen in definierter Orientierung zu erzielen. Aus diesem Grunde ist geplant, sekundäre Zellwandpolymere oder deren biologisch aktive Abbauprodukte, die möglicherweise die kleinste fÜnktionelle Einheit darstellen, kovaleht an feste Träger oder an die Lipidkopfgruppen von Liposomen zu binden. Alternativ können auch Glykolipide synthetiSiert werden, deren hydrophiler Teil aus sekundärem Zellwandpolymer oder aus den entsprechenden biologisch aktiven Abbauprodukten besteht, und die in Lipidfilme oder in Liposomen eingebaut werden. Durch Anwendung der "Surface Plasmon Resonance" Technik sollen die Affinitätskonstanten zwischen der N,-terminalen Region der S-Schicht-Proteine sowie den verschiedenen SLH-Motiven und dem jeweiligen sekundären Zellwandpolymer bestimmt werden. Aufgrund dieser Ergebnisse könnten durch Neukombination ausgewählter SLH-Motive rekombinante SSchicht-Proteine mit niedriger oder hoher Affinität zu sekundären Zellwandpolymeren hergestellt werden. Durch diese Vorgangsweise sollte es weiters möglich sein, dieStabilität von 3-D supramolekularen Strukturen gezielt zu modulieren.`Zur Untersuchung, ob die C-terminalen Aminosäuren der ganzen S-Schicht-Proteine oder der assemblierenden C-terminal verkürzten Formen an der Außenseite des S-Schicht-Gitters liegen, soll die Sequenz des "strep-tag" an die Sequenzen der jeweiligen S- Schicht-Protein-Formen gehängt werden, und die Zugänglichkeit des strep-tag mit Streptavidin untersucht werden. Zur orientierten Bindung und Rekristallisation der "getaggten" S-Schicht-Proteine sollen mit sekundären Zellwandpolymeren funktionalisierte Oberflächen verwendet werden. In einer alternativen Strategie soll strep-tag 11 und ein Cysteinrest in jenen Teil des C-Terminus inseriert werden, der nicht für den S elf-Assembly Prozeß und nicht zur Ausbildung der regelmäßigen Gitterstruktur erforderlich ist. Dadurch kann gleichzeitig nach zwei verschiedenen, an der S-Schicht-Außenseite gelegenen, Aminosäurepositionen gesucht werden. Jene Aminosäurepositionen, die eindeutig als an der S-Schicht-Außenseite liegend identifiziert werden, sollen zur Insertion funktioneller Peptidsequenzen bzw. zur Herstellung von S-Schicht-Fusionsproteinen genutzt werden. Die rekombinanten fünktionellen S-Schicht-Proteine dienen in der Folge zum Aufbau von Biochips und Affinitäts(trenn)strukturen, sowie zur Präparation von Targeting-Strukturen und biomimetischen hnmunogenen. Ein weiteres Ziel ist die 3-1) Kristallisation von N- und C-tenninal verkürzten wasserlöslichen S-Schicht-Protein- Formen. Die Aufklärung der 3-D Struktur von S-Schicht-Proteinen soll in künftigen Entwicklungen Informationen über den Zusammenhang zwischen der Umgebung einer funktionellen Peptidsequenz und ihrer biologischen Aktivität geben.

Kristallin geordnete Protein- oder Glykoproteinschichten (S-Schichten) stellen die äußerste Zellgrenzfläche bei vielen Bakterien und Archaea dar. S-Schichten sind aus identen Protein- oder Glykoprotein-Subeinheiten aufgebaut. Isolierte S-Schicht-Subeinheiten besitzen vielfach die Fähigkeit, an festen Oberflächen, wie Edelmetallen, Silizium oder Glas, an gespreiteten Lipidfilmen oder an Liposomen, in hochgeordnete Monoschichten zu rekristallisieren. Aufgrund der anisotropen Eigenschaften der S-Schicht-Proteine hängt die Orientierung der Monoschichten sowohl von den physikochemischen Eigenschaften des Trägermateriales (Hydrophobizität und Ladung), wie auch von den Versuchsbedingungen (pH-Wert der Lösung, Art und Konzentration von Kationen) ab. Dies ist ein großer Nachteil, wenn rekombinant hergestellte S-Schicht- Fusionsproteine oder rekombinante S-Schicht-Proteine mit inserierten funktionellen Peptidsequenzen für die Rekristallisation zum Aufbau von hochgeordneten Affinitätsmonoschichten verwendet werden. Da der N-terminale Teil von S-Schicht-Proteinen, der vielfach S-layerhomologe-(SLH)-Motive aufweist, ein in das Peptidoglykangrundgerüst eingelagertes sekundäres Zellwandpolymer als Bindungsstruktur erkennt, soll dieses zum Funktionalisieren von verschiedensten Oberflächen genutzt werden, um die Bindung und Kristallisation von funktionellen S-Schicht-Proteinen in definierter Orientierung zu erzielen. Aus diesem Grunde ist geplant, sekundäre Zellwandpolymere oder deren biologisch aktive Abbauprodukte, die möglicherweise die kleinste funktionelle Einheit darstellen, kovalent an feste Träger oder an die Lipidkopfgruppen von Liposomen zu binden. Alternativ können auch Glykolipide synthetisiert werden, deren hydrophiler Teil aus sekundärem Zellwandpolymer oder aus den entsprechenden biologisch aktiven Abbauprodukten besteht, und die in Lipidfilme oder in Liposomen eingebaut werden. Durch Anwendung der "Surface Plasmon Resonance" Technik sollen die Affinitätskonstanten zwischen der N-terminalert Region der S-Schicht-Proteine sowie den verschiedenen SLH-Motiven und dem jeweiligen sekundären Zellwandpolymer bestimmt werden. Aufgrund dieser Ergebnisse könnten durch Neukombination ausgewählter SLH-Motive rekombinante S-Schicht-Proteine mit niedriger oder hoher Affinität zu sekundären Zellwandpolymeren hergestellt werden. Durch diese Vorgangsweise sollte es weiters möglich sein, die Stabilität von 3-D supramolekularen Strukturen gezielt zu modulieren: Zur Untersuchung, ob die C-terminalert Aminosäuren der ganzen S-Schicht-Proteine oder der assemblierenden C-terminal verkürzten Formen an der Außenseite des S-Schicht-Gitters liegen, soll die Sequenz des "strep-tag" an die Sequenzen der jeweiligen S- Schicht-Protein-Formen gehängt werden, und die Zugänglichkeit des strep-tag mit Streptavidin untersucht werden. Zur orientierten Bindung und Rekristallisation der "getaggten" S-Schicht-Proteine sollen mit sekundären Zellwandpolymeren funktionalisierte Oberflächen verwendet werden. In einer alternativen Strategie soll strep-tag II und ein Cysteinrest in jenen Teil des C-Terminus inseriert werden, der nicht für den Self-Assembly Prozeß und nicht zur Ausbildung der regelmäßigen Gitterstruktur erforderlich ist. Dadurch kann gleichzeitig nach zwei verschiedenen, an der S-Schicht-Außenseite gelegenen, Aminosäurepositionen gesucht werden. Jene Aminosäurepositionen, die eindeutig als an der S-Schicht-Außenseite liegend identifiziert werden, sollen zur Insertion funktioneller Peptidsequenzen bzw. zur Herstellung von S-Schicht-Fusionsproteinen genutzt werden. Die rekombinanten funktionellen S-Schicht-Proteine dienen in der Folge zum Aufbau von Biochips und Affinitäts(trenn)strukturen, sowie zur Präparation von Targeting-Strukturen und biomimetischen Immunogenen. Ein weiteres Ziel ist die 3-D Kristallisation von N- und C-terminal verkürzten wasserlöslichen S-Schicht-Protein- Formen. Die Aufklärung der 3-D Struktur von S-Schicht-Proteinen soll in künftigen Entwicklungen Informationen über den Zusammenhang zwischen der Umgebung einer funktionellen Peptidsequenz und ihrer biologischen Aktivität geben.