YBR180w und YDR371 in der Sporulation von Hefe

Forschungsprojekt P 14735 YBR180w und YDR371w in der Sporulation von HefePeter BRIZA27.11.2000 Bei Nährstoffmangel wird in der Hefe Saccharomyces cerecisiae die Bildung von resistenten Dauerformen, den Sporen, induziert. Dieser Prozess umfaßt mehrere Schritte (Induktion Sporulation, Meiose und Rekombination, und schließlich Sporenbildung) und ist ein Modellsystem für Zelldi fferenzierung. Die Oberflächenschichten der Sporenwand sind chemisch völlig anders aufgebaut wie die vegetative Zellwand. Die Hauptkomponente der Sporenoberfläche ist die seltene Aminosäure Dityrosin, das dort in der LL-, DD- und DL-Konfiguration vorkommt. Wir haben die EUROFAN Mutantensammlung nach Stämmen durchsucht, bei denen es zu einer deutlichen Veränderung des Verhältnisses von DL- zu LL-Dityrosin kommt. Dabei haben wir zwei Gene, YBR180w und YDL371w entdeckt, die in diesem Projekt näher charakterisiert werden sollen. Beide Mutanten haben einen ähnlichen Phänotyp: morphologisch sind sie vom Wildtyp ununterscheidbar, aber der Dityrosingehalt der Sporenwände, insbesondere DL-Dityrosin, - deutlich erniedrigt. Aus diesem Phänotyp kann geschlossen werden, daß beide Mutanden bei der Reifung der Sporenwand einen Defekt haben. Ybr180p ist Mitglied der Familie I der WFS-MDR multidrug-resistance` Permeasen. Als Arbeitshypothese nehmen wir an, daß Ybr180p für den Transport von Bisformyldityrosin vom Cytoplasma der Präspore zur reifenden Sporenwand verantwortlich ist. In der Sequenz von Ydr371p wurden Chitinase-Signaturen entdecken, dieses Protein könnte daher eine Chitinase sein. Wir wollen in diesem Projekt die Rolle von Ybr180p und Ydr371p in der Sporulation durch folgende Experimente aufklären: 1. Durch eine genaue phänotypische Charakterisierung der Mutanten soll die Funktion der Genprodukte in der Sporenwandreifung weiter eingeengt werden. Diese Versuche inkludieren die chemische Analyse der Mutantensporenwand und Elektronenmikroskopie. 2. Durch heterologe Expression in vegetativen Zellen soll die enzymatische Aktivität bzw. die Funktion der Genprodukte untersucht werden. 3. Die Fusionen der Proteine mit GFP, einem fluoreszierendem Markerprotein, sollen zur Darstellung der intrazellulären Lokalisierung von Ybrl80p und Ydr371p verwendet werden. 4. Durch Northern-Analyses wird das Expressionsmuster der Gene festgestellt und durch Punktmutationen sollen Promoter- und Regulatorregionen identfiziert werden. 5. Proteinbereiche, die für die Transportfunktion von Ybr180p wichtig sind, sollen bestimmt werden. Eigenschaften dieses Membranproteins sollen mit denen anderer Mitglieder der MFS-MDR Familie verglichen werden. Mit der Arbeit in diesem Projekt verfolgen wir zwei Ziele. In erster Linie wollen wir den Vorgang der Sporenwandreifung im Hefe aufklären. Gleichzeitig hoffen wir aber, daß sich dadurch Möglichkeiten ergeben, medizinisch relevante Probleme studieren zu können. Das multidrug resistance` Protein Ybr180p eröffnet uns hier eine Möglichkeit dazu.

Als Sporulation wird jener Differenzierungsprozess bezeichnet, der wachsende Zellen in resistente Dauerformen (Sporen) umwandelt. Sporen können widrige Umweltbedingungen, z.B. hohe Temperaturen, unbeschadet überstehen und sind daher für die Arterhaltung von Bedeutung. Das chemische und molekularbiologische Verständnis der Sporulation der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae könnte dazu beitragen, die Zelldifferenzierung in komplexen Organismen besser zu verstehen. In diesem Projekt befaßten wir uns mit der Biosynthese der Sporenwand, weil der Aufbau und Bildung dieser ungewöhnlichen Struktur noch nicht vollständig geklärt ist. Wir charakterisierten 2 Proteine, die an der Synthese der Sporenoberfläche direkt beteiligt sind. Wir konnten zeigen, daß Dtr1 in der Prosporenmembran lokalisiert ist und für den Transport von Dityrosin, dem Hauptbestandteil der Sporenoberfläche, verantwortlich ist. Mit diesem Ergebnis kann nun ein fast vollständiges Bild der Synthese der Sporenoberfläche gezeichnet werden. Die unreifen Sporen sind durch eine Lipidmembran, der Prosporenwand, von der umgebenden Mutterzelle getrennt. Diese Membran verhindert den Substanzaustausch zwischen Mutterzelle und Prospore, und dient gleichzeitig als Grundbaustein für die neu zu bildende Sporenwand. Die ungewöhnliche Aminosäure Dityrosin ist der Hauptbestandteil der Sporenoberfläche. Sie wird im Inneren der unreifen Sporen enzymatisch gebildet und an der Außenseite der Prosporenwand weiterverarbeitet. Dtr1 überbrückt die Prosporenwand und ermöglicht so den spezifischen Transport von Dityrosin aus dem Prosporeninneren zur Oberfläche der Prosporenwand, wo es in ein hochquervernetztes, unlösliches Makromolekül umgewandelt wird. Dtr1 gehört zur Familie der `Multidrug resistance` Transporter (MDR). MDR Proteine sind von allgemeinem Interesse, weil sie eine wichtige Aufgabe bei der Entgiftung der Zellen erfüllen. Dtr1 ist zwar auf den Dityrosintransport spezialisiert, kann aber zusätzlich unterschiedliche Toxine aus Hefezellen ausschleusen. Damit ergibt sich die Möglichkeit, die Wirkungsweise von MDR Proteinen mit Hilfe von Dtr1 genauer zu untersuchen. Das zweite von uns untersuchte Protein ist Cts2, ein Chitin abbauendes Enzym, das beim Aufbau einer wichtigen strukturgebenden Zuckerkette der Sporenwand eine Rolle spielt. Auch wenn es auf den ersten Blick widersprüchlich erscheint, das ein abbauendes Enzym bei einem Aufbauprozeß beteiligt ist, so haben unsere Experimente gezeigt, daß ohne Modifikation von Zuckerketten durch Cts2 die Sporenwandsynthese nicht vollständig ablaufen kann.