Functional Genomics der MAPK-Genfamilie von Arabidopsis

Forschungsprojekt P 14751 Functional Genomics der MAPK-Genfamilie von ArabidopsisErwin HEBERLE- BORS27.11.2000 Die Einheit allen Lebens ist die Zelle. Zellen müssen sich mit ihrer Umwelt auseinandersetzen, wozu sowohl die abiotische und biotische Umwelt des Organismus wie auch die anderen Zellen im vielzelligen Organismus gehören. In den letzten Jahren haben sich die MAP-Kinasen (mitogen activated protein kinases) als zentrale Regulatoren von Wachstum, Entwicklung und Stressantworten bei allen Organismen mit echtem Zellkern (Eukaryoten) herausgestellt. Als Proteinkinasen phosphorylieren sie eine Vielzahl an Substraten auf allen Ebenen des Zellgeschehens: sowohl im Bereich des Stoffwechsels, des intrazellulären Transports und des Zellskeletts, als auch im Bereich der Genaktivitdät. Die MAP-Kinasen werden ihrerseits durch ein ebenfalls in der Evolution konserviertes Signaltransduktionsmodul aktiviert, das durch die Bindung von extrazellulären Liganden an zelluläre, Rezeptoren eingeschaltet wird. Auch bei Pflanzen konnte nachgewiesen werden, dass MAP-Kinasen durch eine, Vielzahl an Stimuli aktiviert werden. Diese noch eher deskriptiven Untersuchungen erlaubten es bisher allerdings noch nicht, die funktionelle Bedeutung dieser Aktivierungen für die Pflanze adäquat zu bestimmen und insbesondere, einzelne Stimuli bestimmten MAP-Kinasen in der Zelle zuzuordnen. Im geplanten Projekt soll die funktionelle Genomforschung zur Analyse der MAP-Kinasen im. Modellorganismus Arabidopsis thaliana eingesetzt werden. Wir haben im. fast fertig sequenzierten Genom von Arabidopsis bislang 18 MAP-Kinasegene isolieren können. Die Hauptziele des Projekts sind die Isolierung und Charakterisierung von Knockout-Mutanten von allen MAPK Genen im Genom von Arabidopsis thaliana, und die Erstellung von Expressionsprofilen aller MAP-Kinasen mittels DNA-Chip-Technologie. Mittels PCR sollen international existierende Sammlungen von T-DNA- und Transposon-Insertionsmutanten auf Insertionen in MAP Kinasegenen suchgetestet werden, und dieser reversgenetische Ansatz wird durch phänotypische, biochemische und molekularbiologische Analysen komplettiert. Eine MAPK-Insertionsmutante haben wir schon isoliert. Die Expressionsprofile mittels DNA-Chiptechnologie stellen sehr rasch erstellbare, genomweite Karten der Expression aller MAPK-Gene dar, wie sie zu einer bestimmten Zeit, in einem einzelnen Zelltyp und unter spezifischen Bedingungen exprimiert werden. Diese Ergebnisse werden auch Kreuzungen der MAPK-Knockout-Mutanten untereinander bestimmen, um komplette MAPK-Knockouts zu erzielen. Einen solchen, allerdings noch unvollständigen MAPK-DNA-Chip haben wir bereits hergestellt. Dieser "functional genomics" Ansatz vermeidet eine Reihe von Problemen, die anderen Ansätzen der funktionellen Charakterisierung von Genen, zum Beispiel dem in Pflanzen üblichen Antisense Ansatz, anhaften und stellt eine technologisch neuartige Vorgehensweise in der Analyse von Genfamilien dar. Auf längere Sicht erlaubt dieser Ansatz auch die Identifizierung anderer Signaltransduktionskomponenten, indem einerseits die MAPK-Knockout- Mutanten mit Mutanten in den Genen der anderen Komponenten des MAPK-Signalmoduls gekreuzt werden und andererseits in "Unigene"-Expressionsprofilen nach Mustern geänderter Genexpression in den Mutanten gesucht wird. Dadurch können vor allem die Substrate der MAP-Kinasen identifiziert werden.

Unser interessantestes Ergebnis entstammt dem dritten Teil des Projekts, in dem wir unsere früheren Arbeiten an MAPK-Genen des Tabaks fortsetzten. MAP-Kinasen sind hochkonservierte Proteinkinasen, die eine zentrale Rolle bei der Übertragung von Signalen spielen, die eine Zelle erkennt und die zu verschiedenen Teilen der Zelle übertragen werden müssen, auch dem Zellkern und dem Zytoskelett. Wenn trockener Pollen - im Stadium suspendierten Lebens - auf einer Narbe landet, nimmt er Wasser und wird reanimiert. Dann ist die Bildung des Aktin-Zytoskeletts der entscheidende Schritt zur Pollenkeimung und letztendlich zur Befruchtung. Wir identifizierten eine MAP-Kinase-Kinase, die durch Wasseraufnahme aktiviert wird und wiederum eine bestimmte MAP-Kinase aktiviert, die Profilin, ein aktinbindendes Protein, aktiviert. Die Aktivierung führt zur Dissoziation von Profilaktinkomplexen und zur Polymerisierung von Aktinfilamenten. Damit konnte zum ersten Mal der bisher unbekannte mechanistische Zusammenhang von Pollen-Reanimation und Pollenschlauchbildung identifiziert werden. Im Übrigen ist Profilin ein Allergen. Davon abgesehen, war das P14751-B12-Projekt der Versuch, innovative Methoden zur Analyse einer Genfamilie zu entwickeln, der MAPK-Genfamilie von Arabidopsis thaliana. In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Genomen sequenziert, und der Bioinformatik gelang es, Gene mit vorhersagbarer bzw. unbekannter Funktion zu identifizieren (Genomforschung). Die Aufgabe jetzt ist, die wirkliche Funktion dieser Gene zu bestimmen (funktionelle Genomforschung). Ein wiederkehrendes Thema der funktionellen Genomforschung ist die Redundanz von Genen, d.h. das Vorhandensein von Genfamilien mit Mitgliedern ähnlicher Sequenz und Funktion. Wir identifizierten 20 Mitglieder der Arabidopsis-MAPK-Genfamilie und versuchten, diese als Oligonukleotide auf einen Mikro-Array (DNA-Chip) zu bringen, um die Expression dieser Gene simultan bestimmen zu können. Wir scheiterten jedoch bislang. Es gelang uns jedoch mit anderen Methoden, eine umfassende Genexpressionsanalyse dieser Gene zu machen. Im zweiten Teil des Projekts schalteten wir die MAPK-Gene zuerst einzeln aus, in der Hoffnung, veränderte Phänotypen zu finden. Wir fanden jedoch keine. Wir konnten jedoch in einigen Fällen Veränderungen in der Expression eines zweiten MAPK-Genes finden. In Doppel-knock-out-Pflanzen sieht es so aus, als dass die Pflanzen schon in der Embryonalphase absterben.