Regulation der endothelialen Stickstoffmonoxid-Bindung

Die Bildung von Stickstoffmonoxid (NO), einem weit verbreiteten inter- und intrazellulärem Signalmolekül, wird durch verschiedene Isoformen von NO-Synthasen, die sich bezüglich Gewebsverteilung und Aktivierungsmechanismen unterscheiden, katalysiert. Die endotheliale NOSynthase (eNOS) unterscheidet sich von den anderen Isoformen u.a. darin, daß sie in der Zellmembran im Bereich von Membraneinstülpungen, -den sogenannten Caveolae, lokalisiert ist. Diese Mernbranbindung wird durch eine Interaktion des Enzyms mit dem Strukturprotein der Caveolae, dem Caveolin- 1, bewirkt. Eine Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration durch Aktivierung von membranständigen Rezeptoren bewirkt eine Ca2+/Calmodulin (CaM)-abhängige Dissoziation dieses eN0S/Caveolin-Komplexes und resultiert in einer Aktivierung des Enzyms. Neben diesem, durch Hormone und Transmitter ausgelöstem Ca2+-Anstieg wird die eNOS auch über Scherkräfte aktiviert. Dieser Mechanismus ist Ca2+-unabhängig und beruht auf einer Phosporylierung der eNOS durch die Proteinkinase Akt. Obwohl beide Aktivierungsmechanismen in den letzten Jahren ausführlich untersucht wurden, sind zahlreiche Details über die Regulation der endothelialen NO-Bildung nach wie vor unklar. So konnte u.a. bislang noch nicht geklärt werden, warum eine Phosphorylierung der eNOS durch Akt zur Aktivierung führt und ob dieser Mechanismus auch bei der Ca2+-abhängigen Aktivierung des Enzyms eine Rolle spielt. Da eNOS unter pathophysiologischen Bedingungen, d.h. bei niedriger Konzentration an Substrat bzw. dem Kofaktor Tetrahydrobiopterin, Superoxide-Radikale und H202 bildet, stellt sich auch die Frage ob eine Phosphorylierung der eNOS durch Akt diese sogenannte entkoppelte NADPH Oxidation beeinflußt. Neuerste Ergebnisse zeigen, daß eNOS nicht nur durch die Proteinkinase Akt sondern auch die MAP Kinase ERK phosphoryliert wird. Diese Reaktion ist nach Stimulierung von Endothelzellen mit Bradykinin zu beobachten und führt, wie Untersuchungen an einer in vitro phosphorylierten eNOS zeigen, zu einer Verminderung der Enzymaktivität. Wie diese Hemmung zustande kommt und ob die NO Bildung auch in intakten Zellen bzw. im Gewebe durch ERK reguliert wird, ist unklar. Das vorliegende Projekt hat daher zum Ziel diese Aspekte der Regulation der endothelialen NO Bildung aufzuklären und sollte Antwort auf folgende offene Fragen geben: A) Beeinflußt die durch Akt induzierte Phosphorylierung von eNOS die Affinität des Enyzms zu CaM und/oder die Interaktion mit Caveolin? B) Trägt dieser Mechanismus auch zur Ca2+-abhängigen Aktivierung der eNOS durch Hormone und Transmitter bei? C) Beeinflußt die durch Akt induzierte Phosphorylierung von eNOS auch die entkoppelte NADPH Oxidation und somit die Bildung von Superoxid und H202? D) Über welchen Mechanismus führt die Phosphorylierung von eNOS durch ERK zu einer Verminderung der Enzymaktivität? E) Welche Rolle spielt ERK als Regulator der endothelialen NO Bildung in vivo?

Endothelzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation des Blutdrucks. Sie reagieren auf Hormone oder Scherkräfte mit der Bildung von Stickstoffmonoxid (NO), das zu einer Erschlaffung der benachbarten glatten Muskelzellen und damit zu einer Gefäßerweiterung führt. Katalysiert wird die Bildung von NO durch die endotheliale NO-Synthase (eNOS), deren Aktivität über Änderung der intrazellulären Calcium-Konzentration und Phosphorylierung reguliert wird. Ziel dieses Projektes war es die molekularen Mechanismen der NO-Biosynthese genauer zu untersuchen und so zu einem besseren Verständnis der Regulation des Blutdrucks beizutragen. Im ersten Teil der Arbeit beschäftigten wir uns mit der Regulation der NO-Bildung durch die körpereigenen Botenstoffe Bradykinin und ATP. Dabei konnten wir erstmals zeigen, daß diese Substanzen zwei unterschiedliche Pools an eNOS aktivieren und dabei ausschließlich über eine Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration, nicht aber eNOS Phosphorylierung wirken. Im Zuge dieser Arbeiten konnten wir feststellen, daß eine Inkubation von Endothelzellen mit Bradykinin oder ATP zu einer raschen Desensibilisierung der eNOS führt, die eine langanhaltende Aktivierung des Enzyms verhindert. Darüber hinaus konnten wir auch zeigen, daß Endothelzellen in der Lage sind NO enzymatisch zu Nitrat zu oxidieren und so zu inaktiveren. Basierend auf Untersuchungen mit gereinigter eNOS die zeigen, daß das Enzym in Abwesenheit des Kofaktors Tetrahydrobiopterin (BH4) Superoxid anstelle von NO generiert, sind wir im zweiten Teil des Projektes der Frage nachgegangen ob BH4 auch in intakten Zellen die Bildung von NO und Superoxid reguliert. Dabei konnten wir zeigen, daß eine Hemmung der endothelialen Biosynthese von BH4 zu einem massiven Anstieg der Superoxid- Bildung führt, die durch Blockade der eNOS bzw. Supplementation der Zellen mit BH4 verhindert wird. In Analogie bewirkte eine Depletion an BH4 auch eine verminderte Bildung von NO, was klar zeigt, daß intrazelluläre BH4 Spiegel darüber entscheiden ob eNOS NO oder Superoxid generiert. Zusammen mit Untersuchungen die zeigen, das Herz-Kreislauf-Erkrankungen oft mit erniedrigten zellulären BH4-Spiegeln assoziiert sind, deuten diese Daten, daß die endotheliale Dysfunktion, die im Zuge dieser Erkrankungen auftritt, auf eine verminderte NO-Bildung in Folge von BH4-Depletion und der damit einhergehenden Superoxid-Bildung durch eNOS zurückzuführen ist.