Molekulare Charakterisierung von MIC2/E2 (CD99) Liganden

Der vorliegende Projektvorschlag gründet auf zwei erklärten Zielen: Es sollen einerseits die Liganden der CD99- Ektodomäne identifiziert werden. Andererseits sollen Interaktionspartner der intrazellulären CD99 Abschnitte mittels biochemischer und genetischer Methoden charakterisiert werden. Die Liganden für die CD99-Ektodomäne werden mittels CD99::IgG Fusionsproteinen in klassischen Expressionsklonierungsexperimenten gesucht werden. Als technische Innovation planen wir im Rahmen dieses Projektes neue, dimere Fc-Rezeptor unabhängige Fusionsproteine zu entwickeln. Diese neuen Fusionsproteine werden das Expressionklonieren von Rezeptoren aus Genbanken von Fc-Rezeptor exprimierenden Zellen erleichtern. CD99 wurde ursprünglich als Thymozytendifferenzierungsantigen, als Ewing-Sarkommarker und, aufgrund seiner funktionellen Eigenschaften, als Zelladhäsionsmolekül beschrieben. Das Typ I Membranprotein ist das Produkt. des mic-2,Gens, welches in der pseudoautosomalen Region der humanen X und Y Chromosomen lokalisiert ist. Eine besonders hohe Expressionsdichte mit akzentuierter Membranreaktivität ist charakteristisch für Ewing- Sarkomzellen und sogenannte periphere neuroektodermale Tumoren. Das Ewing-Sarkom, welches den zweithäufigsten malignen Knochentumor im Kindes- und Jugendalters darstellt, ist ein aggressiver osteolytischer Tumor mit Tendenz zur Dissemination. Der immunhistochemische Nachweis einer starken CD99 Membranfluoreszenz, speziell mit monoklonalen Antikörpern niedriger Affinität, trägt auch heute noch zur Differentialdiagnose sogenannter "kleiner runder Tumoren" wesentlich bei, obwohl eine echte Spezifität fehlt. CD99 wird auch von hämatopoietischen Zellen exprimiert, wobei vor allem unreife CD34+ Vorläuferzellen besonders hohe Expressionsdichten aufweisen. Interessanterweise führt eine experimentelle Verminderung der CD99-Expression in B Zellen zur Ausprägung eines Sternberg-Reed Riesenzellenphänomens. Diese Erkenntnisse, über auch die Tatsache, daß dominant aktives Rac als auch experimentelle Überexpression von CD99 einen Hodgkin-Zellphenotyp aufheben können, sprechen für eine kritische Rolle von CD99 in der Regulation der Morphologie, Differenzierung und Dignität einer Zelle. Mehrere Studien in der Vergangenheit haben gezeigt, daß CD99 ein signalübertragendes Molkül ist. Wir konnten den Beweiß Rühren, daß einerseits eine Quervernetzung des CD99 Moleküls auf humanen T Zellen zu einer Anhebung der intrazellulären Kalziumspiegel führt und, daß andererseits CD99 Co-Stimuli zur T Zellaktivierung mit gesteigerter IL-2 Promotoraktivität und Zellproliferation führen und vor allem T Helfer 1 Zytokine induzieren. Interessanterweise führt die CD99 Ligation bei Fehlen eines T Zellrezeptor-Erstsignals zur Aktivierung von pro- apoptotischen Signalwegen, welche zunächst zur Exposition von Phosphatidylserin an der Zelloberfläche und nachfolgend zum Zelltod führen. Physiologische Liganden der CD99 Ektodomäne und der intrazellulären CD99 Domänen sind bislang nicht beschrieben worden. Die Charakterisierung solcher Liganden wird dazu beitragen, die über CD99 vermittelten zellulären Aktivierungsprozesse in B und T Lymphozyten besser zu verstehen. Sie wird auch dazu dienen, die Pathophysiologie maligner Zelltypen, welche vermehrte (die Familie der Ewing-Sarkome) oder aber verminderte CD99 Expression aufweisen (Sternberg Reed Hodgkin Zellen), besser begreifen zu lernen. Die Verfügbarkeit von rekombinanten CD99 Liganden stellt könnet ein nützliches Werkzeug für die Beeinflussung von Erkrankungen mit deregulierter CD99 Expression darstellen und könnte auch dazu verwendet werden, eine geplante T Zell Immunisierung in eine bestimmte (T Helfer 1) Richtung zu lenken.

CD99 wurde ursprünglich als Thymozytendifferenzierungsantigen, als Ewing-Sarkommarker und, aufgrund seiner funktionellen Eigenschaften, als Zelladhäsionsmolekül und Kostimulator für human T Lymphozyten beschrieben. Da phyiologische Liganden für CD99 zum Zeitpunkt der Antragsstellung nicht bekannt waren haben wir es uns im Vorliegenden Projekt zur Aufgabe gestellt mögliche CD99 Liganden zu definieren. Mit Hilfe von CD99-Ig Fusionsproteinen haben wir den ersten lymphozytären Liganden für CD99 auf humanen B Zellen identifizieren können. Dass dieser Ligand auch funktionell relevant ist haben wir in B Lymphozyten Stimulationskulturen zeigen können in denen unser CD99-Fusionsprotein die Proliferation von CD40 plus IL-4 voraktivierten B-Zellen steigern konnte. Die funktionell relevante Interaktion zwischen CD99 und CD99L ist von einem Serumfaktor abhängig, welcher ein Molekulargewicht von mehr als 100 kDa aufweist. Desweiteren konnten wir in einem detaillierten Epitopemapping mittels CD99-Ig Deletionsvarianten mehr als 20 monoklonale Antiköper acht unterschiedlichen Epitopen zuordnen. Interessanterweise binden sogenannte restringierte CD99 Antikörper (CD99R) an unterschiedliche Proteindomänen. Neben der noch andauernden funktionellen Charakterisierung dieser Epitope konnten wir mittlerweile auch ein für myeloische Vorläuferzellen spezifisches Epitop definieren. Die intrazellulären Signalübertragungselemente von CD99 wurden mittels chimärer Ig::CD7::CD99 Konstrukte in Jurkat T Zellen untersucht. Wir konnten mittlerweile zwei für die Signalübertragung relevante Abschnitte im intrazellulären Abschnitt von CD99 definieren. Laufende Studien sollen die Relevanz dieser Molekülabschnitte in primären T Lymphozyten validieren. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass im Rahmen dieses Projektes wichtige biologische und strukturelle Erkentnisse über ein Zelldifferenzierungsmolekül getroffen werden konnten, welche zum besseren Verständnis der Biologie von malignen Erkrankungen (Ewing Sarkome, Leukämien) sowie der Lymphozytenkommunikation beitragen werden.