Transmission mitochondrialer DNA in klonierten Säugetieren

Beim Klonieren mittels Kerntransfer wird in der Regel eine Donorzelle mit einer entkernten Eizelle fusioniert. Verschiedene Typen an Donorzellen sind bisher erfolgreich für die Klonierung verwendet worden: embryonale, fötale und adulte somatische Zellen. Unter der Voraussetzung der Erkennung und richtigen Prozessierung der externen Mitochondrien durch den zytoplasmatischen Apparat der Eizelle, würde man heteroplasmatische Klonlinge erwarten, d.h. diese müßten die mitochondriale DNA (mtDNA) des Donor- -als auch des Empfänger- Zytoplasmas aufweisen. Ziel dieses Projektes ist die Analyse der Zusammensetzung und Weitergabe der mitochondrialen DNA (mtDNA) in Säugetierklonen. Die Untersuchung der Frage der mtDNA-Vererbung während des Klonierens trägt zum Verständnis der mitochondrialen Biogenese und von klonierungs-assoziierten genetischen Mechanismen bei. Darüberhinaus ist die zu untersuchende Fragestellung für die Abschätzung der Sicherheit und Effizienz des Klonierungsverfahrens wichtig. Die Ergebnisse dieses Projektes sollen zeigen, ob durch Kerntransfer klonierte Säugetiere ein Model für das Studium humaner mitochondrialer Krankheiten darstellen. Im einzelnen soll innerhalb des vorliegenden Projektes der Einfluß des Donorzelltyps auf das Vererbungsmuster der mtDNA, der Zusammenhang zwischen dem Ausmaß an Heteroplasrny und möglicher pathologischer Anomalitäten sowie die Frage der Spezies-Spezifität des Auftretens heteroplasmatischer Klonlinge untersucht werden, d.h. ob Heteroplasmie nur im Rind oder auch im Schaf, im Schwein, im Kaninchen oder der Maus durch Klonierung erzeugt kann.

Neben ihrer Rolle bei der zellulären Energieversorgung haben die Mitochondrien weitere Funktionen im inter- und intrazellulären Signalübertragung über die Steroidgenese, mittels Reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), Stickoxide und Kalzium. Mitochondrien sind ebenfalls ausschlaggebend für drei Signalwege, die zum programmierten Zelltod führen und somit die embryonale und fetale Entwicklung beeinflussen. Daraus läßt sich ableiten, dass inadequate oder beeinträchtigte Mitochondrien den Erfolg des somatischen Kerntransfers nachteilig beeinflussen können. Die Ziele dieses Projektes waren (i) die Analyse der mtDNA-Transmission nach intersubspezifischem Kerntransfer beim Rind, (ii) die Analyse der mitochondrialen DNA (mtDNA)- Transmission in klonierten ovinen Feten und Lämmern sowie (iii) der Nachweis, dass Heteroplasmie durch Ooplasma-Transfer zwischen Bos indicus und Bos taurus erzeugt werden kann. (i) Wir bestimmten die mtDNA-Zusammensetzung nach Kerntransfer-Klonierung in einem der numerisch größten Säugetierklone. Die 20 gesunden Klone sind durch Transfer von adulten somatischen Zellen in Zytoplasten mit B. indicus und B. taurus erzeugt worden und wiesen koexistierende mtDNA- Populationen der beiden nah verwandten Unterarten auf. Vier der elf durch Klonierung zwischen den Unterarten erzeugten Rinder waren heteroplasmatisch (0.6% bis 2.8%). Während sieben der neun intrasubspezifischen B. indicus-Klone vergleichbare Heteroplasmiewerte aufwiesen, wurden erstaunlicher Weise im Muskel bzw. in Follikelzellen in einem dieser sieben Tiere Werte von 7.3% und 12.7% gefunden (Steinborn et al., 2002). (ii) Wir untersuchten ebenfalls die Transmission der Donor-mtDNA in klonierten ovinen Feten (n = 7) und Lämmern (n = 5), die aus somatischen Donorzellen mit niedrigen Passagezahlen kloniert wurden. Wir fanden die ersten Fälle von mtDNA-Heteroplasmie (n = 3 Feten, n = 3 Lämmer) nach Kerntransfer-Klonierung beim Schaf. Die drei klonierten Feten wiesen niedrige aber auch erstaunlich hohe Heteroplasmiewerte auf (0.2% - 0.9% bzw. 6.8% - 46.5%). Drei der fünf klonierten Lämmer besaßen mindestens zwei heteroplasmatische Gewebe (Werte zwischen 0.2% und 0.9%). Die Sequenzanalyse der 13 mitochondrial kodierten Proteinuntereinheiten für fünf Klonlinge ergab keinen Zusammenhang zwischen einem Aminosäureaustausch und dem Auftreten von Hetero- oder Homoplasmie. Der Fetus mit dem unerwartet hohen Heteroplasmiewert zeigte im Vergleich zur Donor-mtDNA vier Aminosäureaustausche. (iii) Der Ooplasmatransfer zwischen B. indicus and B. taurus führte zu Heteroplasmie im Ausmass von 8 bis 15%.