Proteinstrukturbestimmung mit paramagnetischen Substanzen

Die Strukturbestimmung von Makromolekuelen mittels NMR Spektroskopie beruht derzeit hauptsächlich auf kurzreichenden Distanz (NOEs) und Diederwinkel (skalare Kopplung) constraints. Ziel dieses Projektes ist die Entwicklung einer neuen Art von Distanz constraints zur NMR Strukturbestimmung. Eine frei lösliche parmagnetische Substanz, welche keine spezifische Wechselwirkungen mit dem Biomolekül zeigt führt zu distanzabhängigen Relaxationszeitsteigerungen. Diese Steigerungen sind größer an der Proteinoberfläche und kleiner im Kern. Die dadurch gewonnenen Abstände von der Oberfläche können als kurz-, mittel-, und weitreichende Distanzinformationen zu Strukturberechnungen herangezogen werden. Zusätzlich zu den Distanzinformationen stellt die Verteilung von Relaxationsratensteigerungen einen qualitativen Parameter über die Form des Makromolekuels dar. Weiters werden spezifisch substituierte paramagnetische Substanzen verwendet, welche Wechselwirkungen mit dem Biomolekuel aufweisen, um experimentelle Informationen über geladene oder hydrophobe Bereiche on der Proteinoberfläche zu gewinnen. Die vorgeschlagenen Methoden werden entwickelt und getest an Proteinen welche bereits umfangreich mittels NMR Spektroskopie untersucht wurden um deren Anwendbarkeit zu zeigen. Anschliessend wird damit die Struktur in Lösung von Fructose-2,6-bisphosphatase, welches ein wichtiger Regulator im Glykolyse/Gluconeogenese Stoffwechsel ist, zu bestimmen.

Eine paramagnetische Verbindung in der Nähe eines NMR aktiven Kerns erhöht dessen Relaxationsrate proportional zu 1/r6 . Wenn so ein paramagnetisches Zentrum frei beweglich in Lösung ist, erhöhen sich die Relaxationsraten von Kernen im Protein abhängig von der Entfernung zur Oberfläche und diese enthalten daher struktur-relevante Informationen. Im Zuge dieses Projektes wurde ein Algorithmus entwickelt welche theoretische Relaxationsratenerhöhungen (Rth ) durch paramagnetische Verbindungen berechnet und zwar durch eine 1/r6 - gemittelte Integration über eine 20 Å dicke Schale um jeden Kern, welche nur das protein-freie Volumen berücksichtigt. Danach werden Unterschiede zwischen diesen berechneten Rth und experimentell ermittelten benutzt um die Distanz jedes NMR beobachtabaren Kernes von der Proteinoberfläche zu definieren. Diese Algorithmen wurde in die Programme CNS und X-PLOR implementiert welche routinemässig für Strukturbestimmungen durch NMR-Spektroskopie und Röntgenkristallstrukturanalyse verwendet werden. Eine erstaunlich gute Übereinstimmung zwischen solchen theoretischen Raten und experimentellen wurden an strukturell gut definierten Proteinen (Lysozym, ParD) gefunden. Wenn die Struktur eines Monomeren bekannt ist, können paramagnetische Proben benutzt werden um die Dimerisierungsstelle zu bestimmen und zwar in Bereichen mit Unterschieden zwischen experimentellen und berechneten Erhöhungen der Relaxationsraten. Dadurch konnte die Dimerstruktur des bakteriellen Antitod ParD ermittelt werden welche später durch intermolekulare NOEs (Wasserstoff-Wasserstoff Distanzen) bestätigt wurde. Neben Proteinen mit bekannter Struktur planen wir auch die Lösungsstruktur von Fruktose-2,6-bisphosphatase mittels paramagnetischer Oberflächenproben zu verifizieren. Dazu wird die bekannte Kristallstruktur eines verwandten Proteins als Startpunkt verwendet und mittels Oberflächendistanzen die Struktur angepasst. Die dafür benötigte NMR Signalzuordnung des Proteins wurde kürzlich fertiggestellt.