Evolution der RNA-Faltungskinetik

Den Sekundärstrukturen der RNA-Moleküle entsprechen im Raum der Sequenzen neutrale Netzwerke, welche aus der Menge aller Sequenzen, die in die gegebene Struktur falten, durch Verbinden aller Sequenzen mit Hammingabstand eins erhalten werden, Die Existenz solcher neutraler Netzwerke und ihrer Überschneidungsmengen wurde vor acht Jahren postuliert und nunmehr experimentell verifiziert (Schultes & Bartel, Science 289 (2000), 448-452; siehe Beilage). RNA-Sekundärstruturen stellen (fast immer) wichtige Zwischenstufen in der RNA-Faltung dar, sind aber dennoch nur sehr grobe Versionen der vollstaendigen Struturen. Sie müssen daher verfeinert werden, um das vorliegenden Modell realistischer zu gestalten. Zwei zueinander kompelmentäre Ergänzungen der konventionellen Strukturen erscheinen in diesem Kontext notwendig: (i) Die Strukturen minimaler freier Energien müssen um suboptimale Konformationen erweitert werden und zusätzlich sollen kinetisch kontrollierte Strukturen betrachtet werden (In formal thermodynamischer Hinsicht bedeutet dies, dass von den 0 K Strukturen auf solche bei endlicher Temperatur übergagangen wird und weiters die für die Faltung zur Verfügung stehende Zeit von unendlich auf realistische Werte reduziert wird). (ii) Die Sekundärstrukturen (verstanden als Listen von Watson-Crick und GU-Basenpaaren) sollen vorerst durch Einbeziehung von tertiären Wechselwirkungen (im besonderen koaxialem `Stacking` und H-typ Pseudoknoten) in Richtung auf dreidimesionale Strukturn erweitert werden. Im Rahmen dieses Projektes sollen die Verteilungen von verfeinerten Eigenschaften der RNA-Moleküle, wie Faltunszeiten und -ausbeuten, auf neutralen Netzwerken von Sequenzen mit gleichen Sekundärstrukturen durch Computersimulation untersucht werden. Wir erwarten das Auftreten von Massen der Sequenzen, welche die Moleküle nach ihren Faltungseigenschaften gruppieren. Darüber hinaus soll untersucht werden, ob die Vertreter der einzelnen Massen uniform über die Netzwerke verteilt sind. Eine solche breite Verteilung hat unmittelbare Konsequenzen für das evolutive Design von Biomolekülen mit vorgebbaren Eigenschaften. Wir planen daher die Verteilung der Faltungseigenschaften von RNA-Molekülen vorerst durch Computersimulation zu ermitteln, um sie später durch ein noch zu ermittelndes mathematisches Modell zu beschreiben, welches die generischen Eigenschaften wiedergeben kann (Im Fall der Netzwerke der Strukturen minimaler freier Energie war ein auf der Theorie der Zufallsgraphen basierendes Modell erfolgreich). Für die geplanten Arbeiten sollen die bereits am Institut vorhandenen und hier entwickelten Algorithmen zusammen mit neuen Methoden zum Einsatz kommen. Ziel ist die Erarbeitung eines umfassenden Modells der kinetischen Faltung von Sequenzen in RNA-Strukturen. Ein kürzlich in unserer Gruppe entwickelter Algorithmus zur Beschreibung der RNA-Faltung ist nicht auf konventionelle Sekundärstrukturen beschränkt. Er wurde in Vorversuchen bereits um die Erfassung von koaxilaem `Stacking` und Pseudoknoten ergänzt. Vorausgesetzt es liegt genügend empirisches Material vor, können auch andere Formen klassifizierbarer tertärer Wechselwirkungen berücksichtigt werden. Wir planen die Berücksichtigung von anderer Klassen von Pseudoknoten (B-Typ) sowie von Basentripletts. Fernziel der Entwicklung ist die Erfassung einer genügend großen Zahl tertiärer Wechselwirkungen, um schließlich wohldefinierte 3D-Stukturen erhalten zu können.

Software-Tools für das Design von Ribonukleinsäure-(RNA)-Schaltern und Komplexen aus zwei und mehr RNA- Molekülen wurden konzipiert, implementiert und getestet. Ein neuer theoretischer Rahmen ermöglicht die einheitliche Beschreibung und Modellierung von evolutionärem und rationalem Design von RNA-Schaltern und anderen Molekülen mit vorgegebenen kinetischen Eigenschaften. RNA-Moleküle rückten in letzter Zeit in den Brennpunkt reiner und angewandter Forschung aus Molekularbiologie, Bioinformatik und Systembiologie. Das Design von RNA-Molekülen zur Regulation zellulärer Prozesse und für therapeutische Zwecke bildet ein vorrangiges Ziel der gegenwärtigen akademischen Forschung und ihrer Anwendung in der Biotechnologie. Trotz der Bedeutung des RNA-Designs sind die Algorithmen für die Strukturvorhersage noch immer ziemlich bescheiden. Um diese Lücke zu füllen, entwickelten und implementierten wir Tools für das Design von RNA-Sequenzen für vorgegebene Strukturen, für die Berechnung aller möglichen Strukturen zusätzlich zur stabilsten Struktur und für die Vorhersage von zeitaufgelösten Faltungsprozessen, kinetische Faltung genannt. Die Forschung im Rahmen dieses Projektes war konzentriert auf den Zusammenhang zwischen kinetischer Faltung und Optimierung von Molekülen durch Evolution. Neue Computerprogramme wurden entwickelt: zur effizienten Berechnung der kinetischen Faltung, zur Simulation der RNA-Optimierung in Flußreaktoren und für simultanes Falten (Cofolding) von zwei oder mehr RNA-Molekülen. Die kinetische Faltung ist der Schlüssel für die Wirkungsweise von RNA-Schaltern, Moleküle mit zwei (oder mehreren) Strukturen, welche steuernd in die Regulation von Genen und metabolischen Prozessen eingreifen. Cofolding ist die Grundlage der Stillegung von Genen durch kleine, interferierende RNA-Moleküle. Die Tools wurden getestet und validiert. Sie werden als Teil des "Vienna RNA Packages" für die akademische Forschung unentgeltlich nutzbar gemacht. Wirtschaftliche Nutzung ist über Lizenzierung möglich. Zusammen mit der Firma Siemens Austria entwickeln wir zur Zeit eine nutzerfreundliche Oberfläche. Ein Fortschritt im Verstehen der Evolution von RNA-Molekülen wurde im Sinne des Projektzieles gemacht: Wie kann die Evolution modelliert werden, wenn Stabilität von Strukturen und Faltungskinetik gleichzeitig Ziele der Optimierung durch Variation und Selektion sind? Wir hatten gefunden, daß viele Sequenzen dieselbe stabilste Struktur ausbilden und nannten alle Sequenzen zusammen das neutrale Netzwerk der Struktur. Dieses Konzept, welches sich als nützlich für effiziente Optimierung von Strukturen erwies, wurde nun komplementiert durch die Gesamtheit der Strukturen, die von einer einzigen Sequenz gebildet werden, bestehend aus stabilster Struktur und suboptimalen Konformationen. Mathematisch ausgedrückt betrachten wir eine Art dualer Abbildung, welche eine Basis für die multikriterielle Optimierung von RNA-Molekülen bildet, wie sie für das Design von RNA-Schaltern oder optimalen Komplexen aus zwei oder mehreren RNA-Molekülen benötigt wird.