Frühe Wundsignaltransduktion in Pflanzen

Verwundung ist für Pflanzen ein besonders schwerer Umweltstress. Sie kann durch mechanische Verletzung, Herbivore oder Patogene verursacht werden. Die Reaktion der Pflanzen auf diese Bedrohung beinhaltet reversible Protein Phosphorylierung, Synthese des Pflanzenhormons Jasmonsäure (JA), Änderungen in der Genexpression und Anpassung des Metabolismus um den gesteigerten Energiebedarf zu decken. Vor kurzem konnten wir zeigen, daß zwei neue Protein Kinasen WAG (wound-activated gylcogen synthase kinase 3) und WIG (wound-induced gylcogen synthase kinase 3) in die frühe Wundantwort der Pflanzen involviert sind. Im vorgelegten Forschungsprojekt wird ein genetischer Ansatz vorgeschlagen um WAG und WIG Kinasen innerhalb der Wundsignaltransduktionskaskade zu plazieren. Arabidopsis Mutanten, deren WAG und/oder WIG Funktionen zerstört sind werden verwendent um zu analysieren, (i) ob WAG und/oder WIG Kinasen die wund- induzierte Akkumulierung von JA regulieren, (ii) ob die wund-induzierten Änderungen in der Genexpression von p50WIG und p53WAG abhängig sind (mittels "Microarray and Cluster Analysis") (iii) ob MAP kinasen und WAG und WIG kinasen auf dem selben oder auf unteschiedlichen Signalwegen liegen. Zusätzlich werden Interaktionsparter von WAG und WIG, die durch einen "Yeast Two Hybrid Screen" isoliert worden sind, charakterisiert. Diese Klone deuten darauf hin, daß WAG und WIG Kinasen die Genexpression durch die Modulation von Transkriptionsfaktoraktivitäten reglulieren könnten und sie ein Bindeglied zwischen der Signalkaskade und den wund-induzierten matabolischen Änderungen darstellen könnten.

Pflanzen werden ständig mit einer Vielzahl von Umweltsignalen konfrontiert. Diese extrazelluläre Signale müssen auf zellulärer Ebene erkannt und anschließend mittels Signalkaskaden weitergeleitet werden, um eine physiologische Antwort auszulösen. Reversible Protein Phosphorylierung stellt einen wesentlichen Mechanismus innerhalb der intrazellulären Informationsübertragung dar. Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK-3) ist eine Serin/Threonin Protein Kinase, die eine Schlüsselrolle in vielen physiologischen Prozessen spielt. Tierische GSK-3 spielt, zum Beispiel, eine wichtige Rolle in der Festlegung der Zellidentität, in der Zellzyklusregulation, in reguliertem Zelltod und in der Entstehung von Krebs. Während Säugetiere zwei GSK-3 Isoformen haben, besitzen Pflanzen eine GSK-3/shaggy-like Kinase (GSK) Multigenfamilie. Erst seit kurzem gibt es einige funktionelle Daten über Pflanzen-GSKs, die zeigen, dass verschiedene GSKs in unterschiedliche physiologische Prozesse, wie z.B. Blütenentwicklung, Brassinosteroid Signalübertragung und Stressantworten, involviert sind. Zuvor hatten wir gezeigt, dass WIG (wound-induced GSK) und WAG (wound-activated GSK), zwei GSKs aus Medicago sativa, während der Wundantwort aktiviert werden. Signalübertragung ist sehr komplex und beinhaltet ein umfangreiches Netzwerk an regulatorischen Interaktionen und Koordinationen. Viele Schlüsselkomponenten werden von verschiedenen Signalwegen verwendet. Deshalb haben wir getestet, ob WIG und WAG nicht nur in der Wundantwort sondern auch in andere Prozesse involviert sind. Tatsächlich konnten wir zeigen, dass WAG nicht nur als Reaktion auf Verwundung aktiviert wird, sondern auch eine wesentliche Komponente in der zellulären Antwort auf Salzstress sein könnte. Hohe Salzkonzentrationen, aber weder Kälte noch Trockenheit, induzieren WAG Kinaseaktivität in Wurzeln. Arabidopsis Pflanzen, die MsK1 konstitutiv überexprimieren sind signifikant resistenter gegenüber hohen Salzkonzentrationen. Dies deutet darauf hin, dass WAG ein positiver Regulator der Salztoleranz ist. Immunolokalisierungsstudien zeigten überraschenderweise, dass WAG eine plastidäre GSK, die mit Stärkekörnern assoziiert, ist. Im Rahmen dieses Projekts untersuchten wir, ob auch andere Mitglieder der GSK Familie in die Stress- Signalübertragung involviert sein könnten. Biochemische Studien zeigten, dass MsK1 auf Stressbedingungen anspricht. Immunokinase Assays mit MsK1-spezifischen Antikörpern zeigten, dass MsK1 unter normalen Wachstumsbedingungen in Blättern und Wurzeln aktiv ist. Wenn Blätter jedoch mit dem Herbizid Paraquat, das die Produktion von Superoxid Anionen in Chloroplasten induziert, behandelt wurden nahm die Kinaseaktivität rasch ab. In Wurzeln führte Behandlung mit Zellulase zur Inaktivierung von MsK1. Inaktivierung von MsK1 war gefolgt von einem Proteasom-abhängigen Abbau des MsK1 Proteins. Um die funktionelle Rolle von MsK1 zu untersuchen, stellten wir transgene Arabidopsis Pflanzen her, die MsK1 konstitutiv überexprimieren, und analysierten deren Antwort auf unterschiedliche Stressbedingungen. In Keimungstests zeigten die MsK1- überexprimierenden Pflanzen eine erhöhte Resistenz gegenüber Paraquat und Zellulase. Interessanterweise waren die MsK1-überexprimierenden Pflanzen empfindlicher gegenüber Infektion mit einem virulenten Stramm des Bakteriums Pseudomonas syringae nicht aber gegenüber einem avirulenten Isolats dieses Bakteriums. Zusammenfassend zeigt unsere Arbeit, dass einige, verschiedene GSKs in die Antwort auf unterschiedliche abiotische und biotische Stressbedingungen involviert sind. Die Aktivität verschiedener GSKs wird unterschiedlich reguliert. Während die Kinaseaktivitäten von WAG und WIG unter normalen Wachstumsbedingungen niedrig sind und durch Stress stimuliert werden, scheint MsK1 konstitutiv aktiv zu sein und unter Stress inaktiviert zu werden. Der Proteasom-abhängige Proteinabbau von MsK1 stellt einen neuen Mechanismus der Regulation von GSKs dar, der bis dato in keinem anderen Organismus beschrieben wurde.