Charakterisierung eines neuen Amplikons im Hepatoblastom

Das Ziel des vorliegenden Projektes ist es, molekulare Mechanismen aufzuklären, die bei der Entstehung und Entwicklung des Hepatoblastoms, eines seltenen aber hoch malignen kindlichen Leberkrebses, eine Rolle spielen. In den letzten Jahrzehnten konnte eine Reihe von Onkogenen und Tumorsuppressor-Genen entdeckt werden; häufig deshalb, weil diese von wiederkehrenden genetischen Veränderungen betroffen sind, die nur in bestimmten Krebsarten oder auch in vielen verschieden Krebsarten aufgefunden werden. Die Auffindung solche Gene kann wichtige Informationen liefern, die für die Prognose der Patienten eine bedeutende Rolle spielen, wie zum Beispiel die Entdeckung der MYCN-Gen-Amplifikation beim Neuroblastom zeigte. Darüber hinaus können sie wichtige Informationen für neue therapeutische Ansätze liefern. Eine kürzlich veröffentlichte Studie an einer grossen Anzahl von Tumoren hat gezeigt, dass der Zugewinn des langen Arms bzw. von Teilen des langen Arms des Chromosoms 8 in Hepatoblastomen mit einer schlechten Prognose für die Patienten einhergeht. Die kritische Region in diesem Chromosomen-Arm war auf die Chromosomen-Banden 8q11.2-q13 beschränkt, da einer der untersuchten Tumoren Amplifikation nur dieses Bereichs zeigte. Die Identifizierung prognostisch relevanter Gene in dieser Region kann daher zur Verbesserung der Diagnose und letztendlich auch der Therapie des Hepatoblastoms führen. Wir haben daher den genannten Primärtumor mit Hilfe der s.g. "2-dimensionalen Elektrophorese genomischer Restriktionsfragmente" untersucht und konnten dadurch mindestens vier Gene entdecken, die in der kritischen Region lokalisiert sind und in diesem Tumor amplifiziert vorlagen. Drei dieser Gene sind bekannte "Proto-Onkogene" (möglicherweise Krebs-fördernde Gene), die durchaus für die Malignität von Hepatoblastomen verantwortlich sein könnten. Daher ist eines der Hauptziele des Projektes, die Rolle dieser Gene für die Malignität des Hepatoblastoms aufzuklären. Weiters sollen das Ausmass und die Grenzen der kritischen Region in den Chromosomen-Banden 8q1 1.2-ql 3 in einer grossen Anzahl von Hepatoblastomen festgestellt werden, um so alle Gene, die sich in der kleinsten gemeinsamen Region befinden, auf ihre Krebs-fördernde (onkogene) Wirkung im Hepatoblastom zu überprüfen. Darüber hinaus möchten wir feststellen, welche biologischen "pathways" durch die Amplifikation der interessantesten Gene, die wir so zu finden hoffen, von Veränderungen betroffen sind. Unsere bisherigen Untersuchungen am Hepatoblastom und anderen kindlichen und embryonalen Krebsarten zeigen, dass die kombinierte Anwendung der vergleichenden genomischen Hybridisierung und der 2-dimensionalen Elektrophorese genomischer Restriktionsfragmente eines der wirksamsten Hilfsmittel darstellt, um Gene zu entdecken, die von genomischen Veränderungen betroffen werden. Gleichzeitig hat der enorme Fortschritt, der bei der Aufklärung des menschlichen Genoms in den letzten Jahren durch das humane Genomprojekt erziehlt wurde, dazu beigetragen, dass die beschriebenen Methoden noch schneller zur Auffindung solcher Gene führen. Da in den letzten Jahren sehr viele genomische Regionen gefunden werden konnten, die wahrscheinlich Gene mit onkogener oder Krebs-unterdrückender Wirkung beherbergen, besteht grosses Interesse, ähnliche Methoden, wie in diesem Projekt beschrieben, auch bei anderen Krebsarten zur Auffindung von Genen einzusetzen. Wir werden also bei der Durchführung des vorgeschlagenen Projekts Erfahrungen sammeln können, wie die vorhandenen Informationen über das humane Genom am besten genutzt werden können, um sie auch in weiteren geplanten Projekten anwenden zu können.

Onkogene sind Gene, die in der normalen Zelle eine wichtige Rolle in verschiedensten Prozessen, wie Zell- Wachstum, -Tod, -Differenzierung etc., spielen. Werden sie aber aufgrund genetischer Veränderungen abnorm exprimiert, wird also ein verändertes oder zuviel des Genproduktes oder zu einem falschen Zeitpunkt hergestellt, so kann dies zur Entstehung von Tumoren führen. Die Erhöhung der Kopienzahl eines Gens, also die Gen- Amplifikation, ist ein häufig beschrittener Weg, wie es zur Überexpression von Onkogenen in Tumorzellen kommt. Über die Untersuchung von Chromosomenregionen, die in einer oder verschiedenen Tumor-Arten immer wiederkehrend amplifiziert sind, können neue Onkogene identifiziert werden. Die Auffindung solcher Onkogene, die in bestimmten Tumor-Arten eine Rolle spielen, ist wichtig, um die zellulären Mechanismen, die zur Entstehung/Entwicklung der Krebs-Art führen, zu verstehen. Dabei ist es natürlich immer ein Ziel und die große Hoffnung der Forschung, dass die dabei gewonnenen Erkenntnisse Eingang in die klinische Praxis finden, entweder durch die Entwicklung von prognostisch wichtigen Markern (Hinweisgebern) oder, um neue spezifische Therapie- Ansätze entwickeln zu können. Das primäre Ziel des bearbeiteten Projektes war, ein oder mehrere solcher Onkogene, die an der Entstehung des Hepatoblastoms (HB), einer äußerst aggressiven kindlichen Form von Leber-Krebs, beteiligt sind, aufzudecken. Ausgangspunkt war dabei die Beobachtung, dass Amplifikation eines Teils des Chromosomen-Arms 8q in HB mit einer extrem schlechten Prognose einhergeht. Wir konnten ein Onkogen, PLAG1, in dieser Chromosomen-Region identifizieren und zeigen, dass dieses Gen in fast allen untersuchten HBs überexprimiert ist, auch in jenen Patienten, die keine Amplifikation des Gens aufwiesen. Weiters konnten wir Hinweise darauf geben, dass die vermehrte Produktion von PLAG1 in HB auch für die Regulation eines wichtigen fötalen Wachstumsfaktors - IGF2, von dem schon bekannt war, dass er in HB überproduziert wird, verantwortlich ist. All dies lässt darauf schließen, dass möglicherweise die erhöhte Produktion von PLAG1 bei der Entstehung von HB beteiligt ist. Unsere Daten können aber auch dahingehend interpretiert werden, dass zwar sowohl PLAG1 und damit auch IGF2 in HB erhöht sind, dass dies aber nicht ursächlich mit der Entstehung des Tumors zusammen hängt, sondern nur den undifferenzierten, der fötalen Leberzelle entsprechenden, Zustand der HB-Zelle widerspiegelt. Bei der Durchführung dieses Projektteils konnten wir in unserem Labor ein sehr effizientes Methoden-Spektrum zur Auffindung amplifizierter Gene etablieren. Wir haben dieses sodann auch eingesetzt, um Amplifikationen des langen Arms des Chromosom 11 in leukämischen Zellen von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) zu untersuchen. Bis dato wurde vermutet, dass die Amplifikation des MLL-Gens entscheidend ist, da MLL aufgrund anderer genetischer Veränderungen (Translokationen, Duplikationen), an der Entstehung von Leukämien beteiligt ist, und in den allermeisten 11q-Amplifikationen auch enthalten ist. Unsere Untersuchungen haben aber zwei neue Erkenntnisse erbracht: erstens setzen sich die 11q-Amplicons (die amplifizierten Einheiten) aus verschiedene Regionen des Chromosomen-Arms 11q zusammen, und zweitens, sind zusätzlich zur MLL-Gen Region auch noch zwei weitere Regionen häufig in den leukämischen Zellen amplifiziert. Die eine der beiden Regionen, 11q13.5, enthält einige Gene, die möglicherweise eine Rolle als Onkogene spielen könnten. Dies herauszufinden, ist die Aufgabe unserer gegenwärtigen und zukünftigen Untersuchungen.