Biogenese von Peroxisomen in Hefe

Peroxisomen sind spezialisierte Organellen der eukaryotischen Zelle und spielen eine wichtige Rolle beim Abbau von Fettsäuren und der Biosynthese verschiedener Lipide. Genetisch bedingte Mangelerscheinungen haben für den Menschen letale Folgen. Über den Mechanismus ihrer Entstehung, Vermehrung und Weitergabe an die Tochterzellen ist noch wenig bekannt. Die entsprechenden Proteine werden im Cytoplasma synthetisiert und in weiterer Folge in die peroxisomale Matrix importiert oder in die Membran inseriert. Die in diesem Projektantrag beschriebenen Experimente sollen dazu dienen, die molekularen Mechanismen dieser Vorgänge in einem Modellsystem, der Hefe Saccharomyces cerevisiae, aufzuklären. Dazu sollen vesikuläre Vorläufer dieser Organellen spezifisch markiert und gereinigt werden, und die Zusammensetzung ihrer Membran und ihres Inhalts biochemisch analysiert werden. Der komplizierte Vorgang der Biogenese kommt u.a. durch eine Vielzahl von Protein-wechselwirkungen zustande. Manche der beteiligten Proteine zeigen Interaktionen mit vielen verschiedenen Proteinen, bei anderen sind noch keine bekannt, z.B.: beim Pex15-protein. Im vorliegenden Projekt sollen Wechselwirkungspartner dieses peroxisomalen Membranproteins gefunden werden, und in weiterer Folge sollen diese in vivo durch Co- immunopräzipitation nachgewiesen werden. Molekulare Mechanismen können oft nur dann in allen Details aufgeklärt werden, wenn der entsprechende Vorgang in vitro nachgebaut werden kann. Dies ist beim Import peroxisomaler Proteine in die Peroxisomen bisher noch nicht gelungen. Erste Versuche zum Aufbau eines derartigen in vitro-Systems sind ein wesentlicher Teil des vorliegenden Projekts.

Die meisten metabolischen Reaktionen einer Zelle werden von Proteinen ausgeführt. Viele Reaktionen finden in Substrukturen einer Zelle statt. Dies hat den Vorteil, daß die Zwischenprodukte von Reaktionsketten näher beinander bleiben, daß vorhandene Energie besser genutzt wird, und daß in ein und derselben Zelle auch die gleichen Reaktionen in entgegengesetzte Richtungen ablaufen können. Es gibt viele Möglichkeiten herauszufinden, welche Reaktion in welchem Kompartiment stattfindet, doch der technische Fortschritt ermöglicht es, alle Proteine eines Kompartiments gleichzeitig zu bestimmen. Voraussetzung ist allerdings ein sehr hoher Reinheitsgrad der entsprechenden Organelle. Ein wesentliches Ergebnis dieses Projekts ist die Entwicklung einer neuen Methode zur Isolierung von hochgereinigten Peroxisomen, lebenswichtigen Organellen von hoher Flexibilität, und erste Daten über den Proteininhalt dieser Kompartimente. Trennungen mittels Zentrifugation wurden mit Methoden der Immunaffinitätsreinigung kombiniert. Zu diesem Zweck wurde im Laufe dieses Projekts ein neuer Marker entwickelt und verwendet. Membranproteine der Peroxisomen wurden mit diesem neuentwickeltem Marker fusioniert und zur Isolierung ganzer Organellen eingesetzt, wobei nicht alle Membranproteine gleich gut verwendbar waren. Proteine, die in ein Kompartiment importiert werden sollen, besitzen eine Signalsequenz, und im Fall der Peroxisomen ist diese meist am C-Terminus der Aminosäuresequenz zu finden. Sequenzanalysen und Bioinformatik ermöglichen heute in vielen Fällen eine recht genaue Vorhersage über die Struktur und den Aufenthaltsort des jeweiligen Proteins. Für peroxisomale Proteine haben wir im Zuge dieses Projekts gemeinsam mit der Gruppe von F. Eisenhaber (IMP, Wien) ein neues und sehr zuverlässiges Programm zur Vorhersage entwickelt und getestet.