ADP-Heptose Analoga

Für die vielfältigen physiologischen Funktionen der äusseren Zellwandmembran von Gram-negativen Bakterien sind spezifische Zuckerstrukturen (Lipopolysaccharide - LPS) von essentieller Bedeutung. Gendefekte mit Auswirkungen auf die Biosynthese bestimmter - strukturell konservierter - Abschnitte führen zum Verlust der Barrierefunktion der äußeren Membran, bewirken eine erhöhte Durchlässigkeit für hydrophobe Antibiotika und eine deutlich verringerte Virulenz der Bakterien. Zentraler Gegenstand des Projekts ist die chemische Synthese von nativen phosphorylierten Strukturen und stabilen Derivaten bakterieller Heptosen (C-7 Zucker). Die Syntheseprodukte sollen zur vollständigen Aufklärung der Biosynthese der bakteriellen Heptoseregion herangezogen werden und in weiterer Folge auf ihre Eignung als Inhibitoren der beteiligten Enzyme untersucht werden. In Vorarbeiten konnten wesentliche neue Erkenntnisse zur chemischen Struktur des natürlichen Substrats für die Heptosyltransferasereaktion gewonnen werden. Nachdem das physiologische Substrat - ein Heptosenucleosiddiphosphat - chemisch instabil ist, sollen stabile Analoga synthetisiert werden, die auf dem Ersatz des glycosidischen Sauerstoffs an C-1 durch hydrolysebeständige C- Gruppen beruhen, sowie weitere Heptoseanaloga, deren OH-Gruppe an C-2 durch Fluor, Azid oder Wasserstoff ersetzt werden. Diese werden in der Folge zu Phosphon- und Phosphorsäureestern und den Nukleotid-aktivierten Zuckern umgesetzt. In den Vorarbeiten konnten auch Hinweise auf die vor dem Transferase-Schritt liegenden enzymatischen Umsetzungsreaktionen erhalten werden. Diese beinhalten eine Reaktionssequenz über eine Kinase-, Phosphatase-, Nucleotidheptosesynthase- und Epimerasereaktion. Die phosphorylierten Syntheseprodukte sollen daher auch als Substrate für breit angelegte biochemische Studien an diesen 5 Schlüsselenzymen der Heptosebiosynthese eingesetzt werden. Von der zuletzt genannten Epimerase existiert seit kurzem eine Röntgen-Kristallstruktur, die erstmalig für ein an der Biosynthese der LPS-Kernregion beteiligtes Enzym vorliegt. Mit den synthetischen Substraten sollen daher die Raumstrukturen der Enzym-Substrat- und Enzym-Produktkomplexe ermittelt werden, um detaillierte Kenntnisse zum Bindungsvorgang und dem Reaktionsablauf im aktiven Zentrum dieses Enzyms zu erhalten. Als Ergebnis der Arbeiten ist zu erwarten, dass diese Daten die Grundlage zu einem verbesserten und rationalen Design von Inhibitoren als neue Leitsubstanzen in der antibakteriellen Wirkstoffforschung liefern werden.

Heptosen (C-7) Zucker sind weit verbreitete Kohlenhydrate in Gram-negativen Bakterien mit vielfältigen physiologischen Funktionen. Gendefekte mit Auswirkungen auf die Biosynthese dieser Zucker führen zum Verlust der Barrierefunktion der äußeren Zellwandmembran und bewirken somit eine erhöhte Durchlässigkeit für bestimmte Antibiotika und eine deutlich verringerte Virulenz der Bakterien. Zentraler Gegenstand des Projekts war die chemische Synthese von nativen Phosphat-hältigen Strukturen und stabilen Derivaten bakterieller Heptosen. In Kooperation mit dem Department für Nanobiotechnologie der BOKU (FWF-Projekte Dr. Paul Messner) gelang eine vollständige Aufklärung der Biosynthese bakterieller Heptosen durch direkten Vergleich der Syntheseprodukte mit gereinigten bakteriellen Extrakten. Für die Übertragung und Aktivierung dieser Zucker konnten fünf Schlüsselenzyme und deren genetische Basis identifiziert werden, wobei erstmals zwei bisher nicht bekannte zusätzliche Schritte in der Biosynthese - Übertragung eines Phosphatrestes an C-1 und Abspaltung des Phosphats in der Seitenkette der Heptose - bekannt wurden. Darüber hinaus konnte auch erstmals die Existenz von zwei verschiedenen Biosynthesewegen in Bakterien nachgewiesen werden und die genetische Organisation der beteiligten Enzyme in pathogenen Keimen wie Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Mycobacterium tuberculosis und vielen anderen Enterobakterien ermittelt werden. Zusätzlich zur chemischen Synthese der physiologischen Zwischenprodukte wurden auch Analoga hergestellt, da eine Form der aktivierten Heptose nur kurze Zeit beständig ist und spontan durch Hydrolyse abgebaut wird. In den stabilen Derivaten wurde Sauerstoff an C-1 durch eine Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung ersetzt und somit ein genereller Zugang zu neuen stabilen Mimetika aktivierter Zuckerphosphate erarbeitet. Weitere Analoga mit Desoxygenierung im Zuckerring wurden durch eine Indium-katalysierte Kettenverlängerungsreaktion hergestellt. Weiters werden die synthetischen Substrate zu kristallographischen Untersuchungen eingesetzt um die Raumstrukturen der Enzym-Substrat- und Enzym-Produktkomplexe zu ermitteln und um detaillierte Kenntnisse zum Bindungsvorgang und zum Reaktionsablauf im aktiven Zentrum dieser Enzyme zu erhalten. Die struktur- und biochemischen Ergebnisse dieser Verbindungen in Bezug auf die Blockierung der Heptose-Übertragung und Epimerasereaktion sind aber noch ausständig. Es ist zu erwarten, dass diese Daten die Grundlage zu einem rationalen Design von Inhibitoren als neue Leitsubstanzen in der antibakteriellen Wirkstoffforschung liefern werden.