Moleculare Aspekte der Säure-Basen Adaptation der Niere

Die zentrale Rolle der Niere in der Aufrechterhaltung des Säure-Basen-Gleichgewichts des Organismus beruht auf der Fähigkeit zur Ausscheidung überschüssiger Säuren oder Basen. Die im Stoffwechsel in Form überschüssiger Protonen netto anfallenden nicht flüchtigen Säure-Äquivalente können in drei möglichen Formen über die Niere ausgeschieden werden: als titrierbare Säure (haupsächlich als Phosphat), in Form von Ammonium-Ionen oder als freie Protonen. Metabolische Azidose induziert in der Niere eine Vielzahl adaptiver Veränderungen. Die größten metabolischen Veränderungen finden sich in den Epithelzellen des proximalen Tubulus. Die Enzymaktivitäten der phosphat- abhängigen Glutaminase (PDG) und der zytosolischen PEPCK nehmen zu, was in einer erhöhten Glutaminextraktion und in einer erhöhten Exkretion von Ammonaik sowie in einer erhöhten Resorption von Bikarbonat resultiert. Dadurch kann das gestörte Säure-Basen-Gleichgewicht wiederhergestellt werden. Die säure- induzierte Zunahme der PEPCK kommt durch eine gesteigerte Transkriptionsrate zustande, während im Falle der PDG-Aktivitätssteigerung eine Erhöhung der Stabilität der PDG mRNA beobachtet werden konnte. Die molekularen Mechanismen, die zur erhöhten Genexpression führen, sind aber noch weitgehend ungeklärt. So ist bis heute nicht bekannt, über welche "Sensoren" eine Nierenepithelzelle Änderungen im extrazellulären pH-Wert detektiert und wie dieses Signal dann die Anschaltung spezifischer Gene reguliert. Im Rahmen des derzeit laufenden Projekts P12705-MOB konnte mit Hilfe von LLC-PK1-FBPase+ Zellen, einer glukoneogenen, pH-responsiven Nierenzell-Linie, von uns kürzlich gezeigt werden, daß es der intrazelluläre pH- Wert ist, der diese adaptiven Antworten auslöst. Untersuchungen zur Möglichkeit einer Beiteiligung von MAP Kinase Signalkaskaden an der Signalvermittlung erbrachten, daß weder die ERK Kaskade, noch der JNK Signalweg daran beteiligt sind. Deshalb wurde von uns eine mögliche Beteiligung des dritten MAPK Signalweges, über p38 MAP Kinase, im Rahmen von Projekt P12705-MOB eingehend untersucht. Inkubation von LLC-PK1-FBPase+ Zellen in saurem Kulturmedium (pH 6.9) induzierte eine biphasische Phosphorylierung, und damit Aktivierung, von p38, mit einem Maximum nach 1 h und 9 h nach Azidose. Die Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors ATF-2, eines bekannten Substrats von p38, war entsprechend zeitverzögert. Inkubation der Zellen mit dem Proteinsynthese-Hemmer Anisomycin (AI), oder in hyperosmolaren Konzentrationen von Sorbit, beide Manöver aktivieren p38, induzierten eine zeit-abhängige Phosphorylierung von p38 und ATF-2. Cycloheximid (CHX), ein weiterer Hemmer der eukaryontischen Proteinsynthese, zeigte keine Wirkungen auf die Phosphorylierung von p38 oder ATF-2. AI induzierte weiters den zellulären Gehalt an PEPCK mRNA, wie unter Säure-Induktion zu beobachten ist, während CHX keinen Einfluß auf die PEPCK Induktion zeigte, was die vorhergehenden Ergebnisse bestätigte. SB203580 (SB), ein spezifischer Hemmer der p38 MAP Kinase, blockierte die Säure- und die AI-induzierten Zunahmen der zellulären PEPCK mRNA-Gehalte. Auch die Phosphorylierung von ATF-2 konnte durch SB vollständig gehemmt werden. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, daß die AI- und die Säureinduzierte PEPCK-Zunahmen durch einen SB-sensitiven p38 MAPK Schritt vermittelt werden. In weiterer Folge konnte gezeigt werden, daß ATF-2 an die CRE-1 Region des PEPCK Promoters bindet und aller Vorausssicht nach die erhöhte PEPCK Transkription steuert. Im vorliegenden Projektantrag sollen diese Versuche fortgesetzt und auf die Untersuchung weiterer Substrate von p38, wie nachgeordnete Kinasen oder Transkriptionsfaktoren, ausgedehnt werden. Weiters ist geplant, übergeordnete Kinase Kinasen eingehender zu untersuchen. Parallel dazu soll mit Hilfe der cDNA Microarray-Technologie ein breites Programm zur Identifizierung pH- regulierter Gene in der Niere initiiert werden. Dieser innovative Versuchsansatz eröffnet erstmals völlig neue Einblicke in die transkriptionelle Regulation der renalen Säure-Basen-Adaptation.