Funktion und Regulation von humanem Cyclin A

Die Vermehrung von Zellen durch Zellteilung ist durch eine im Lauf der Evolution konservierte Familie von Kinase reguliert. Diese Kinasen benötigen, um ihre Substrate phosphorylieren zu können eine aktivierende Untereinheit, die sogenannten Cycline. Die Oszillation der Cycline während des Zellzyklus bewirkt die zyklische Aktivierung und Inaktivierung der cyclinabhängigen Kinasen, die den Zellzyklus regulieren. Cyclin A is ein konserviertes Cyclin, das vom Beginn der DNA-Replikation bis zur Mitose in Zellen exprimiert wird, dessen genaue Funktion aber nicht bekannt ist. In der Mitose werden die mitotischen Cycline (Cyclin A und Cyclin B) durch Ubiquitin-mediierte Proteolyse degradiert. Ich habe mich in Vorarbeiten mit den Unterschieden in der Degradation zwischen Cyclin A und B1 beschäftigt und gefunden, dass Cyclin A auch in humanen Zellen immer vor Cyclin B1 degradiert wirdn. Cyclin A, B und andere Proteine, wie etwa der Anaphaseinhibitor Securin, werden durch den gleichen Mechanismus, nämlich Ubiquitin-mediierte Proteolyse zerstört. Wenn Zellen durch Spindellzellgifte in Mitose arrettiert werden, verhindert der sogenannte mitotische `Checkpoint`, dass Cyclin B1 und Securin degradiert werden, während Cyclin A jedoch instabil bleibt. Der Mechanismus dieser selektiven Stabilisierung ist nicht bekannt. In einem ersten Versuch diese Unterschiede zu erklären, ist es uns gelungen Unterschiede in der sogenannten `destruction box`, einer Proteinsequenz, die für die Proteolyse notwendig ist, zu identifizieren. Weiters fanden wir, dass die Degradation von Cyclin A in Mitose notwendig ist, um die Schwesterchromatide trennen zu können und um Mitose ordnungsgemäss zu beenden zu können. In diesem Projekt, will ich diese Analysen fortsetzen, um zu verstehen, wie Cyclin A in Mitose degradiert wird. Vor allem geht es um den Erkennungsmechanismus wie Substrate für die geregelte Proteolyse erkannt werden und warum der mitotische `Checkpoint`-Mechanismus nur einen Teil der unstabilen Proteine vor der Zerstörung bewahrt. Diese Analysen sollen mittels in vitro Degradationsexperimenten durchgeführt werden. Besondere Bedeutung kommt in diesem Projekt aber der Analyse von grün fluorsezierenden Cyclinen zu. Dazu werden Fusionsproteine zwischen Cyclinen und dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) hergestellt, in Zellen exprimiert, und durch Zeitrafferfluoreszenzmikroskopie quantitativ erfasst. Die Bestimmung der GFP-Fluoreszenz dient in diesem Verfahren als Maß für die Proteinkonzentration und -stabilität. Weiters wollen wir humane Zellinien etablieren, in denen Cyclin A nur von einem regulierbaren Gen exprimiert wird, das vollständig abgeschalten werden kann. In solchen Zellinien kann man dann die genaue Funktion des Cyclin A untersuchen, die immer noch nicht eindeutig bestimmt ist.

Für eine erfolgreiche Vermehrung benötigt die Zelle Cyclin A, welches zwei den Zellzyklus regulierende Kinasen (Cdk1 und Cdk2) durch direkte Bindung aktiviert. Die Expression von Cyclin A ist daher in allen proliferierenden Zellen hoch, v.a. aber in der DNA-Synthese Phase (S) und der darauf anschließenden G2-Zellzyklusphase. Cyclin A wurde daher schon in vielen Malignomen mit vermehrter Proliferation und schlechterer Prognose für den Patienten assoziiert. Wir haben in dieser Studie an der Analyse der Cyclin A Expression in Hodgkin Lymphomen mitgewirkt. Dazu wurde ein sogenannter `tissue-array` verwendet, mit dessen Hilfe mehrere Hundert Tumorproben gleichzeitig untersucht werden können. In Kollaboration mit Stephan Dirnhofer, Institut für Pathologie; Universität Basel, konnten wir zeigen, dass in nahezu allen Fällen von Hodgkin Lymphomen, die transformierten Reed- Sternberg-Zellen positiv für Cyclin A waren, während die umliegenden reaktiven Lymphozyten, die erwartete Zellzyklusphasen spezifische Expression von Cyclin A aufwiesen. Dies ist interessant, da Reed-Sternberg Zellen einen sehr niedrigen Proliferationsindex aufweisen, woraus geschlossen werden kann, dass sich Reed-Sternberg Zellen in einem aberranten Zellzykluszustand befinden. Um die Regulation der normalen Cyclin A Expression studieren zu können, haben wir Zelllinien generiert, in welchen Cyclin A induziert werden kann. Die Analyse dieser Zellen ergab, dass Cyclin transkriptionell als auch durch Proteolyse während der G1-Phase reprimiert wird. Interessanterweise unterscheiden sich Cyclin A Mutanten hinsichtlich ihrer Stabilität während der Mitosephase und der darauf folgenden G1-Zellzyklusphase, was auf eine komplexe Regulation des Cyclin A Proteins hinweist. Während unserer Untersuchungen zur Cyclin A-Degradation in Mitose haben wir entdeckt, dass Expression von stabilem cyclin B1, im Gegensatz zu stabilem Cyclin A, die Aufteilung der Chromsomen während der Mitosephase verhindert. Wir konnten diesen Effekt auf die Aktivität von hKid, einem Chromokinesin zurückführen, welches die Trennung der Chromsomen währen der Anaphase verhindern kann. Um die Funktion von Cyclin A in der Zellteilung humaner Zellen untersuchen zu können, haben wir ein neues induzierbares System etabliert, welches die gezielte Inaktivierung eines Genes in humanen Zellen, durch Induktion der sogenannten RNA-Interferenz erlaubt. Um dieses System zu etablieren haben wir einen regulierbaren Promoter hergestellt, dessen Aktivität durch Tetrazyklin Zugabe ins Nährmedium reguliert werden kann. Dieser Promoter reguliert die Expression eines kurzen RNA Moleküls, welches sich in der Zelle zu einem dopplesträngigen RNA Molekül faltet, welches durch Aktivierung einer Endonuklease führt, welche die zur Sequenz des kurzen RNA Moleküls komplementäre zelluläre mRNA zur Degardation bringt. Mit diesem System konnten wir die Cyclin A Spiegel in humanen Zellen senken und zeigen, dass Cyclin A für die Proliferation von humanen Zellen essentiell ist. Da diese RNAi` genannte Technologie jedoch oft nur unvollständige Depletion des Proteins bewirkt, habe wir zahlreiche Methoden entwickelt oder weiterentwickelt mit welchen ein Gen vollständig inaktiviert werden kann. Diese Methoden wurde angewendet um sogenannte gene-targeting Vektoren zur Inaktivierung von Genen in embryonalen Stammzellen der Maus durchzuführen und werden gegenwärtig zur Inaktivierung von humanen Genen in Zellkulturlinien ausgetestet.