Ladungsreduzierte ESI Mehrstufen MS von bioaktiven Molekülen

Die Entwicklung von "sanften" Desorptions/Ionisierungstechniken und die Verbesserung von Analysatoren hat in den letzten zwei Jahrzehnten zu dramatischen Fortschritten in der massenspektrometrischen Charakterisierung sowohl von Biopolymeren, wie Peptide oder Proteine, als auch niedermolekularen, thermolabilen und polaren Molekülen, wie Steroid-konjugate und Glykokonjugate, geführt insbesondere die zerstörungsfreie Generierung von intakten, mehrfach geladenen Biomolekülen in der Gasphase. Während bei anderen Techniken, wie der Desorption/Ionisation mit hochenergetischen Spaltfragmenten des Californiums-252 Plasmadesorption, oder mit Photonen bei der matrixunterstützten Laserdesorption/Ionisation (MALDI), noch Molekulargewichtsbegrenzungen durch den Analysator bzw. das Detektorsystem bestehen, gelang mit Hilfe eines Elektrosprayvorganges unter Atmosphärendruck (Elektro-sprayionisation, ESI) Proteinmoleküle, die sich in hochaufgeladenen Aerosoltröpfchen befinden, werden zerstörungsfrei in die Gasphase übergeführt und tragen gleichzeitig meist eine große Zahl von positiven oder negativen Ladungen ein Durchbruch zu Makromolekülen jenseits eines Molekulargewichtes von einer Million Dalton. Ein besonders wichtiges Merkmal dieser Technik, die zum großen Erfolg beigetragen hat, liegt in der großen Zahl von Ladungen (z = 4-50) die an den Analytmolekülen stabilisiert werden können, wodurch der gemessene m/z Wert dramatisch herabgesetzt wird und herkömmlichen, hochauflösenden massenspektro-metrischen Analysatortypen wie Magnetfeld-, Quadrupol- oder Ionenfallenanalysator eingesetzt werden können. Die Miniaturisierung des Sprayvorganges in den Nanobereich hinein, erlaubt nun Flußraten im Nanoliter/Minuten-Bereich und die Bildung von Aerosoltröpfchen im Nanoliter- Volumenbereich, wodurch lange Analysenzeiten und extrem gute Detektionsgrenzen erzielbar sind 10 min bis 70 min Meßzeit und Substanzmenge im Pikomol-Bereich (10-12). Während die ESI als auch MALDI Massenspektrometrie bereits erfolgreich zur exakten Molekulargewichtsbestimmung von Biomolekülen eingesetzt wurden, eröffnet die Kombination der Nano ESI mit einer Ionenfalle die direkte Primärstrukturbestimmung von Peptiden und Glykokonjugaten basierend auf mehrstufigen Zerfallsprozessen (konsekutive Kollisionen mit neutralen Gasmolekülen in der Ionenfalle), wie sie optimal in Quadrupolionenfallen (syn. Paulfalle, Nobelpreis in Physik an W. Paul) durchgeführt werden können. Das Studium der Zerfallsvorgänge in der Ionenfalle von tryptischen Peptiden (z.B. von allergenen Proteinen), Peptidoglykanfragmenten (aus Zellwänden von pathogenen Bakterien), Steroidhormonen, Phytoöstrogenen (aus Oberflächenwässern und Fischen) und Lignanen (aus Nahrungsmitteln) und die Korrelation mit den bekannten und oft unbekannten Strukturen im Ultraspurenbereich stellt nun den anwendungsorientierten Teil des Projektes dar, wodurch zukunftsweisende Perspektiven für die analytische Chemie, Umweltchemie und Lebensmittelchemie eröffnet werden können. Eine neue Art von Nano ESI Quelle soll gebaut und getestet werden, die es erlauben soll die Ladungszahl der Analytmoleküle zu steuern. Diese Ladungsreduktion soll mit Hilfe einer a-Teilchenquelle in einer Neutralisationskammer erfolgen. Primär sollen einfach geladene Peptidmoleküle generiert werden, die mehrstufige Zerfallsvorgänge ermöglichen, die einfacher zu interpretieren sind als wenn der Zerfall von mehrfach geladenen Molekülionen ausginge. Bei der Molekulargewichtsbestimmung von Gemischen tryptischer Peptide (generiert aus Proteinen) und deren Sequenzbestimmung wäre dies ein großer Vorteil. Identifizierungen von Proteinen, wie sie in der Proteomforschung oft nötig sind, könnten damit wesentlich erleichtert werden. In diesem Zusammenhang steht auch der Versuch eine Optimierung der on-line Kopplung von isoelektrischer Fokussierung in der Kapillare mit ESI Ionenfallenmassenspektrometrie für intakte Proteinen und Glykoproteinen zu erzielen. Damit wäre ein 3- dimensionales Bild (bestehend aus dem pI Werten, den Quantitäten und Molekulargewichten der Einzelproteine) von komplexen, natürlich vorkommenden Proteingemischen rasch und hochempfindlich erzielbar.

Das Hauptresultat des Projektes war die Konzeption und der Bau einer Prototypenionenquelle, die an kommerzielle Massenspektrometer verschiedensten Typs und unterschiedlicher Hersteller angebracht werden kann. Dies hat auch zu einer Diensterfindungsmeldung an die TU Wien geführt und soll zu einem internationalen Patent angemeldet werden. Diese neue Nanoelektrosprayionisationsquelle erlaubt die verbesserte Manipulation der Ladungszahl von Biomolekülen mittels einer verkapselten Po-210 Quelle. Die so resultierenden massenspektrometrischen Daten führen zu einer schnelleren und eindeutigeren Identifikationen von Proteinen auf dem Gebiet der Proteomik. Mit Hilfe dieses neuen Geräteteils sollte es schlussendlich möglich sein, schneller neue Biomarker zu finden, die in der Diagnostik von menschlichen Erkrankungen von Relevanz sind bzw. ein besseres Monitoring therapeutischer Ansätze erlauben wird. Weiters sollte damit eine on-line Detektion und Strukturaufklärung von Luftverunreinigungen (z.B. Phthalate aus technischen Polymeren oder andere organische Luftverunreinigungen) in der Umwelt mit höchster Empfindlichkeit möglich sein. Innerhalb des Projektes wurden auch grundlegende Untersuchungen über die Machbarkeit einer Strukturdatenbank für bioaktive, niedermolekulare Verbindungen durchgeführt. Die erhaltenen, positiven Resultate für eine derartige zu entwickelnde Datenbank haben eine hohe Relevanz für forensische Untersuchungen, Metabolomik und auch der Analyse von illegalen Drogen.