Biochemische Charakterisation der Proteinase Separin

In eukaryontischen Zellen findet die Replikation der DNA während der S-Phase des Zellzykluses statt. Die Trennung der neu replizierten Chromosomen findet jedoch erst beim Übergang von der Metaphase zur Anaphase statt. Die Schwesterchromatiden bleiben bis zu diesem Zeitpunkt von einem Proteinkomplex, der Cohesin genannt wird, zusammengehalten. Die Trennung der Chromosomen wird durch die Aktivierung eines Proteins, welches Separin genannt wird, initiiert. Dieses Protein führt die spezifische Proteolyse einer Untereinheit des Cohesinkomplexes durch. Dieses Phänomen scheint in fast allen Eukaryonten konserviert zu sein. Das Protein Separin ist vor kurzem als eine Proteinase mit einem Cystein als Nukleophil identifiziert worden. Aminosäuresequenzvergleiche zeigen eine Ähnlichkeit über 120 Aminosäuren zu den Caspasen und den Enzymen Gingipain und Legumain, die Mitglieder des CD-Clans der Cysteinproteinasen sind. Bis jetzt ist nichts über den enzymatischen Mechanismus, die Substratspezifität oder die drei-dimensionale Raumstruktur der Separine bekannt. Das Ziel dieses Projektes ist es, eine solche Charakterisierung durchzuführen. Die folgenden Versuche werden durchgeführt, um dieses Ziel zu erreichen. Es wird erstens notwendig sein, ein rekombinantes Expressionssystem für Separine zu etablieren, da es nicht möglich sein wird, genug Material aus eukaryontischen Zellen in der Mitose zu isolieren. Daher werden cDNAs, die den proteolytischen Domänen der Separine aus S. cerevisiae, S. pombe, D. melanogaster and H. Sapiens entsprechen, in herkömmliche prokaryotische Expressionsvektoren eingeführt. Damit können die Proteine in grossem Massstab hergestellt werden; nachher können sie durch Affinitätschromatographie oder herkömmliche Methoden der Proteinchemie aufgereinigt werden. Separine aus vier verschiedenen Organismen werden aus zwei Gründen exprimiert. Das Verhalten eines Proteins kann erstens in einem Expressionssystem nicht vorausgesagt werden. Nur durch Experimentieren kann man feststellen, welche Proteine stabil in grossen Mengen in einem rekombinanten System exprimiert werden können. Ein Vergleich von Separinen aus verschiedenen Spezies wird es ermöglichen, das Geeigneste auszusuchen. Nachdem genügend grosse Mengen an reinem Separin hergestellt worden sind, wird ein Assaysystem mit fluorogenischen Substraten entwickelt. Die Substrate werden aus Hexapeptiden bestehen, die die sechs Aminosäuren vor einer Separin-Spaltstelle auf dem gespaltenen Cohesin enthalten (die Spaltstellen sind für die Separine aus S. cerevisiae and S. pombe bekannt und können durch Sequenzvergleiche für die zwei anderen Organismen vorhergesagt werden). Die optimalen Bedingungen und enzymatische Parameter können mit diesem System bestimmt werden. Die Trennung der Schwesterchromatiden ist ein essentielles Ereignis für die Zellteilung und das Zellwachstum; daher stellt dies ein Ziel für Inhibitoren und für die Entwicklung von Antibiotika dar. Da dieser Mechanismus aber auch in Säugetierzellen vorkommt, ist es wichtig Inhibitoren zu finden, die für Pilzenzyme spezifisch sind aber keine Wirkung auf die der Säugetiere zeigen. Um solche Moleküle zu entwerfen, ist ein breites Wissen über die Substratspezifitäten der Separine eine notwendige Voraussetzung. Dies ist ein grosses Ziel dieses Projektes. Die Methoden werden einerseits der Einsatz von fluorogenischen Peptidbibliotheken und andererseits ein genetisches Screeningsystem, entweder in Bakterien oder in der Hefe, sein. Schliesslich wird dieses Wissen und seine Bedeutung für die Synthese von Inhibitoren durch die Bestimmung der drei-dimensionalen Struktur einer proteolytischen Domäne eines Separins untermauert und ergänzt werden.

Das Ziel dieses Projektes war die sowohl biochemische als auch strukturelle Charakterisierung des eukaryontischen Proteins Separin, ein Protein das für die Spaltung von Cohesin und dadurch für die Trennung der Chromosomen während der Mitose und Meiose verantwortlich ist. Um dieses Ziel zu erreichen, müssen ausreichende Mengen an gereinigtem Protein vorhanden sein. Am Anfang setzten wir verschiedene Expressionssysteme in Bakterien ein, um das Protein herzustellen. Als Quelle des Separins standen cDNAs von der Backhefe, der Fruchtfliege und dem Menschen zur Verfügung. Trotz dieser Möglichkeiten ist es uns nicht gelungen, Separin in ausreichender Menge herzustellen. Die Hydrophobizität des Proteins macht es selbst bei niedrigen Konzentrationen unlöslich. Versuche, das Protein aus Inklusionskörpern wieder löslich zu machen, schlugen auch fehl. Wir versuchten mittels Bioinformatik ein verwandtes Protein aus Prokaryonten zu finden, denn möglicherweise würde das prokaryontische Protein in Bakterien löslicher sein. Die Separine sind Mitglieder einer Proteingruppe, die eine Domäne besitzen, die "caspase-haemoglobinase" Faltung genannt wird. Ein publizierter Datenbankvergleich zeigte, dass Proteine aus bestimmten Cyanobakterien wie Anabaena variabilis und Nostoc species Ähnlichkeiten zum aktiven Zentrum der Separine hatten. Diese prokaryontischen Proteine werden HetF und HetF-like genannt. Die zwei Proteine werden, wie ihre Namen andeuten, für die Bildung von Heterozysten benötigt. Diese Organellen fixieren Stickstoff und werden in einer Umgebung ohne gebundenen Stickstoff hergestellt. Die Heterozysten stellen eine niedrige Sauerstoffumgebung her und schützen damit die Nitrogenase. Die genaue Funktion dieser Proteine ist noch nicht bekannt, sie scheinen aber die Aktivität des Proteins HetR zu regulieren. HetR ist interessanterweise selbst eine Proteinase. Wir exprimierten die HetF und HetF-like Proteine von A. variabilis und Nostoc sp in E.coli. Die Expression und Reinigung vom HetF-like Protein von A. variabilis war im Milligramm Bereich erfolgreich. Versuche, Proteinkristalle zu generieren, obwohl in zwei Laboratorien in Wien und Barcelona angesetzt, scheiterten. Das Problem war die niedrige Löslichkeit des Proteins bei den benötigten hohen Konzentrationen. Eine Überprüfung mit einem Proteinaseverdau zeigte, dass 90% des Moleküls gegen Verdau resistent war, eine Tatsache, die auf eine korrekte Faltung des Proteins hindeutet. Wir nehmen an, dass die verdauten Teile nicht strukturiert waren und daher den Niederschlag verursachten. Die proteinase-resistente Domäne stellt eine gute Möglichkeit dar, in Zukunft Kristalle vom HetF-like Protein zu bekommen und damit die Struktur von einem Mitglied dieser wichtigen Proteingruppe zu bestimmen.