Targeting des humanen Serotonintransporters

Die Neurotransmission wird durch Entfernung des Neurotransmitters aus dem synaptischen Spalt beendet. Dies geschieht durch enzymatischen Abbau. oder durch die - ökonomischere - Wiederaufnahme des Neurotransmitters, eine Reaktion, die durch Neurotransmittertransporter vermittelt wird. Die Na+ /Cl- -abhängigen Neurotransmittertransporter stellen eine große Unterfamilie (>12 beim Menschen) von dieser Transportern dar. Sie verfügen über gemeinsame Strukturmerkmale (z.B. einen hydrophoben Kern von 12 transmembran-verlaufenden Segmenten) und funktionelle Eigenschaften (z.B.: sie verwenden den Na+ -Gradienten als Energiequelle für den Substratcotransport; der Substratflux ist daher mit einem lonenstrom verbunden; exogene Substrate können zur Transportumkehr führen). In polarisierten Zellen, wo diese Transporter endogen exprimiert sind, werden sic nicht gleichmäßig über die Zelloberfläche verteilt sondern in distinkte Subkompartimente der Zellmembran. Das trifft vor allem auf Nervenzellen zu, wo die Transporter über das Axon zur präsynaptischen Membran adressiert werden (typischer Weise sind sie nicht direkt an der aktiven Zone der Synapse sondern unmittelbar perisynaptisch lokalisiert). Es ist zur Zeit unklar, wie dieser zielgerichtete Einbau (="targeting") des jeweiligen Transporters stattfindet, insbesondere wie er nach seiner Biosynthese in das richtige Vesikel gelangt (="sorting), in das axonale Ende geliefert (="delivery), in die präsnypatische Membran eingebaut und vor allem dort verankert wird (="retention"). Die Arbeitshypothese des gegenwärtigen Antrages geht davon aus, dass die Komplexität der Signalübertragung und der Signalintegration in Nervenzellen nur verständlich werden kann, wenn diejenigen Faktoren bekannt sind, die die räumliche Verteilung von Transportern regulieren. Der humane Serotonintransporter (SERT) soll als Modellsystem dienen, um die Mechanismen des "targeting" zu untersuchen. SERT ist sowohl der Angriffspunkt therapeutisch wichtiger Arzneimittel (klassische trizyklische Antidepresseva, SSRI=selektiver Serotoninrückaufnahmeinhibitoren etc.) als auch von Substanzen, die missbräuchlich verwendet werden (z.B. Ecstasy. und andere Amphetaminderivate). Es ist daher offensichtlich, dass ein mechanistisches Verständnis der Regulation von SERT für die klinische Medizin entsprechend relevant ist. SERT ist ein prototypischer Neurotransmittertransporter, der daher einem axonalen Targeting unterliegt. Folgende Annahmen liegen der Arbeitshypothese zugrunde: - The räumliche Segregation von SERT innerhalb von Nervenzellen ist auf dessen Interaktion mit distinkten Proteinen zurückzuführen. - Diese selektive Interaktion wird durch Abschnitte von SERT vermittelt. Diese Domänen müssen die Information tragen, die eine axonale "Delivery" and prasynaptische Retention - und möglicherweise auch Ausbildung von "Clusters" - spezifizieren. - Targeting von SERT muss reguliert werden; die präsynaptische Membran, in die SERT inseriert wird, ist sehr weit (bis > 0.5 m) vom Ort der Synthese (= im Nervenzellkörper) entfernt; es muss einen Mechanismus geben, der für einen kontinuierlichen Nachschub sorgt. Die Ziele des Projektes liegen darin, diese Annahmen zu verifizieren; insbesondere, soll(en) (i) Targeting von SERT in einer permanenten, neuron-ähnlichen Zelllinie und in Nervenzellen untersucht werden, (ii) sowohl diejenigen Sequenzabschnitte von SERT identifiziert werden, die das Targeting spezifizieren, als auch diejenigen Proteine, die mit diesen Abschnitten des Transporters assoziieren (iii) und bewiesen werden, dass diese Proteine an der axonalen "Delivery" und/oder Retention von SERT beteiligt sind. Wir gehen davon aus, dass die Beobachtungen auch für andere verwandte Neurotransmitter Transporter (z.B. Noradrenalin- und Dopamintransporter) relevant sind. Daher soll das Projekt Einblicke und Erkenntnisse zu den Mechanismen liefern, die der neuronalen Signalverarbeitung und der synaptischen Plastizität zugrunde liegen. Wir hoffen ein Modell zu entwickeln, das auch als Grundlage dafür dienen kann, die pathophysiologische Bedeutung des Targeting von SERT zu prüfen.

Nervenzellen setzen Neurotransmitter frei, diese werden aus dem synaptischen Spalt durch Neurotransmitter- Transporter wieder aufgenommen. Diese Transporter gehören zu einer großen Familie von Proteinen, die strukturelle, funktionelle and topologische Gemeinsamkeiten aufweisen. Im vorliegenden Antrag haben wir Natrium-abhängige Neurotransporter-Symporter untersucht; diese sind besonders interessant, weil (i) sie wichtige therapeutische Angriffspunkte sind (Antidepressiva hemmen den Noradrenalin- und den Serotonintransporter; das Antiepileptikum Tiagabin hemmt den GABA-Transporter-1); (ii) einige beliebte illegale Drogen [Cocain, Amphetamin, Methamphetamin, MDMA (=ecstasy) etc.] lösen ihre Effekte über diese Transporter aus; (iii) Neurotransmitter-Transporter werden spezifisch in die präsynaptische Membran der Nervenzelle eingebaut. Wie die Spezifität dieses Vorganges erzielt wird, ist unklar: Während seiner Synthese wird der Transporter in das endoplasmatische Retikulum (= ER) inseriert, dann vom ER über zahlreiche intrazelluläre Kompartimente in das Axon gebracht und an den Rand der Synapse geliefert. Das vorliegende Projekt wollte die zugrunde liegenden Vorgänge erhellen. Die ursprünglich vorgesehene Strategie war nicht zielführend. Am Beginn des Projektes beobachten wir aber, dass Neurotransmitter-Transporter Homooligomere sind (d.h. sie bilden miteinander Komplexe). In der Folge wurden strukturelle Elemente in Transportern identifiziert, die ihre Oligomerisierung stabilisieren. Dank dieser Einblicke konnten wir mit gezielten Mutationen die Oligomerisierung hemmen. Die resultierenden mutierten Transporter wurden in der Zelle retiniert, weil sie das ER nicht verließen. Dies legt den Schluss nahe, dass die Oligomerisierung eine Voraussetzung für den Export der Transporter aus dem ER ist. Unser Arbeitsmodell postulierte, dass die Oligomerisierung für die Assemblierung der Komponenten der ER- Exportmaschinerie notwendig war. Diese "Oligomerisierungshypothese" wurde überprüft, u.a. wurden Bindungsstellen für diese Komponenten im Carboxyterminus von Transportern gefunden. Was bringen diese Erkenntnisse? Bei einer dominant vererbten Erkrankung, der familiären orthostatische Hypotonie, liegt eine Mutation im Noradrenalintransporter vor. Da die Mutation dominant ist, muss der vom normalen Allel codierte Transporter auch funktionslos sein - warum? Dank unserer Erkenntnisse konnte das Rätsel gelöst werden: Der mutierte Transporter steckt im ER und hält den "gesunden" Transporter zurück, weil Transporter oligmerisieren. Unsere Experimente haben auch gezeigt, dass die Oligomerisierung von Transportern eine Voraussetzung dafür ist, dass Amphetamine (die die Transportrichtung umkehren) seine Effekte auslöst: "amphetamines take two to tango".